多灶原发性前列腺癌表现出高度的基因组异质性

多灶原发性前列腺癌表现出高度的基因组异质性

单位：分子肿瘤学系，癌症研究所，奥斯陆大学radiumhospitalet医院，奥斯陆，挪威；

杂志：European Urology ，IF：20.096

关键词：前列腺癌，多病灶，外显子组测序，异质性，体细胞突变

摘要

背景：

       大多数原发性前列腺癌是多灶性的，各个肿瘤具有不同的侵袭性；然而，人们对这些肿瘤之间的基因组异质性知之甚少。目的：为了更好地了解不同病变之间临床变异的生物学基础，我们试图全面表征多灶性前列腺癌体细胞基因突变的异质性。结论：在第一次对原发性前列腺癌的大型基因组异质性研究中，我们观察到同一患者体内的不同肿瘤病灶在遗传上是不同的，很少共享任何体细胞基因突变，包括常见的癌症驱动基因。这种异质性影响了以基因组为基础的前列腺癌管理的实施，因为来自所有肿瘤病灶的信息对于得出癌症基因组改变的有效结论是必要的。患者总结：大多数原发性前列腺癌由同一器官内的多个肿瘤组成，但对它们之间的关系知之甚少。 我们比较了这些肿瘤中的基因突变集，发现它们只有极少数的共同点。这将影响未来的治疗决策，因为每个肿瘤的突变都会使其独一无二，并且必须考虑获得最佳治疗结果。

前言：

       前列腺癌是西方世界男性中最常见的癌症类型，比其他癌症更具侵袭性，前列腺癌每年导致全世界 25 万人死亡。绝大多数患者有多个肿瘤病灶。由于大多数前列腺癌是多灶性的，并且不同的驱动突变可以在不同的肿瘤灶内活跃，因此非常需要对前列腺癌的异质性进行更彻底的调查。已经发表了一些利用高通量测序解决多灶性的研究，但这些研究受到对极少数患者（2~5 名患者）的分析的限制，并且关于前列腺细胞如何进化和产生个体癌症病灶的争议仍然存在。因此，本文首次对一个大的多灶性前列腺癌队列进行了高覆盖率全外显子组测序。通过对这些数据的分析，发现了大程度异常的病灶间异质性，这将对未来前列腺癌研究的临床决策和设计产生影响。

实验设计：

材料：本研究中使用的癌症和良性样本选自 2010-2012 年期间在奥斯陆大学医学院接受根治性前列腺切除术的 571 名患者。患者队列主要由中危和高危癌症患者组成。从每个前列腺切除标本中，从前列腺的不同切片和区域取出三到七个组织样本（平均为 5.5 个）并新鲜冷冻。记录前列腺内每个样本的位置，并由泌尿病理学家评估周围区域以设置 Gleason 评分并记录样本在哪个肿瘤病灶内采集。

       从 41 名不同患者的 89 个肿瘤中精心挑选了 153 个样本，每个患者至少2个肿瘤样本和1个良性对照样本（表 1）。 仅选择来自明显分离的病灶（相距> 2-4 mm）的样本进行全外显子测序。

方法：

测序： HiSeq 2500 (109肿瘤样本+40良性样品)+4个其它

比对：BWA（0.7.8）

转换：SAMTOOLS(0.1.19)

标记重复：picard(1.102)

序列重排：GATK IndelRealigner

比对矫正：GATK BaseRecalibrator 和 AnalyzeCovariates

变异获取（SNV）： MuTect v1.7.2 和 Strelka v1.0.14

变异注释： ANNOVAR (v2016-03-15)和公共数据库注释： NCBI RefSeq genes and transcript tracks, COSMIC v76, dbSNP build 144, and InterPro domain structure v56.

DNA拷贝数分析：ADTEx(v2.0)

变异评分： Ensembl Variant Effect Predictor v.80 (VEP)

突变基因筛选： MutSigCV v1.4 和Oncodrive-fm

替换特征： SomaticSignatures

结果描述：

一、多灶性前列腺癌的概况

       每个肿瘤病灶由一到两个样本代表，以促进对病灶间和病灶内异质性的分析。每个肿瘤样本的中位覆盖深度为 239 (Q1 = 218, Q3 = 256)，非癌样本的中位覆盖深度为 93 (Q1 = 86, Q3 = 106)，至少 80% 的肿瘤样本中靶向碱基的覆盖度为100 或更多（补充表 2）。

二、突变位点统计和突变基因筛选

       为了评估数据的代表性，在调查突变异质性之前将一般突变模式与先前发表的研究中的突变模式进行了比较。共鉴定了 4084 个体细胞突变（补充表 3），并观察到与先前发表的原发性前列腺癌相同类型的突变特征（补充图 1）。 在 4084 个突变中，1378 个发生在一个高度突变的肿瘤样本中。该样本在核酸外切酶 POLE 中含有非同义突变 (T881A)，这可能解释了高突变率。

       通过使用两种不同的算法搜索可能导致致癌的基因突变，这些算法的选择基于比预期更高的频率识别突变的能力 (MutSig) 和潜在的功能后果 (Oncodrive-fm;补充表 5）。   考虑了两种算法中排名前 20 的基因，并专注于在多个患者中反复突变的基因，总共增加了 27 个独特基因。在 27 个基因中，我们发现了先前与前列腺癌有关的基因，例如 MED12、FOXA1、SPOP、MARCA1 和 CTNNB1，以及新基因。

三、DNA 损伤修复基因分析

        专门寻找 BRCA1/2 和 DNA 错配修复基因中的体细胞突变。没有观察到 BRCA1 突变； 然而，BRCA2 在来自三个肿瘤的五个样本中发生了突变。 我们还在每个样本中观察到 MSH6 和 MSH4 突变。有趣的是，所有含有这些基因突变的样本都比平均水平有更多的突变。

四、融合基因TMPRSS2-ERG分析

       调查的肿瘤样本中，大约一半的肿瘤样本中发现了一个或多个得分最高的基因突变(55/112)。有趣的是，对已知融合基因TMPRSS2-ERG的RT-PCR分析显示，没有这些基因突变的样本比有突变的样本更常表达融合基因(36/57 vs 16/55;Fisher精确检验，p < 0.001)。

五、DNA拷贝数分析

       我们还利用外显子组测序数据来研究 DNA 拷贝数改变（补充方法），包括全基因组（补充图 4 和补充表 6）和关注已知在前列腺癌中通常改变的单个基因。

       在这些基因中，我们数据集中改变最频繁的是KX3-1、RB1和CDKN1B，分别在24%、25%和12%的样本中发生改变。有趣的是，大多数DNA拷贝数的改变都是在我们得分最高的基因发生突变的相同样本中发现的。事实上，突变数量与基因组中DNA拷贝数畸变百分比之间存在很强的相关性。

注：体细胞点突变数(SNVs + indels)与DNA拷贝数改变的基因组部分之间的样本相关性。p值和系数表示为斯皮尔曼相关性。

六、大程度的病灶间异质性

       基因突变统计：接下来89个肿瘤病灶间的异质性，并观察到每个肿瘤病灶中独特的基因组被改变。当研究所有1971个突变基因的病灶间异质性时，（1）在得分最高的基因中，来自同一患者不同肿瘤病灶的样本平均只有不到一个共同的突变 (图1)。（2）只有两个基因在任何患者的多个肿瘤病灶的同一位点发生了突变(图2)，反映了高度的异质性。

注：大多数突变在同一患者的肿瘤病灶中并不共享。上图:每一个前列腺内得分最高的突变基因。下图:基因通常因DNA拷贝数畸变而改变。每一列代表一个病人，每一行代表一个基因。橙色:一个患者体内多个肿瘤灶的点突变/DNA拷贝数改变(常见)。色:一个患者体内一个肿瘤灶的点突变/DNA拷贝数改变(独特)。

       同一患者不同肿瘤病灶间突变统计分析：89 个被调查的肿瘤病灶来自 41 名患者，其中 34 名患者的具有2个肿瘤病灶和7名患者的具有3肿瘤病灶。这给出了肿瘤病灶之间总共 55 种可能的成对比较 (34 x 1 + 7 x 3 = 55)。病灶间异质性很大，55个比较中有42个(76%)没有发现共同突变(下图)。事实上，89个肿瘤病灶中有63个(71%)与同一患者的其他肿瘤病灶没有任何共同突变。41例患者中有30例发现了这63个肿瘤灶，这意味着73%的患者在同一前列腺中至少有一个肿瘤灶与另一个肿瘤灶没有共同突变。

       DNA拷贝数的改变也观察到高度的局间异质性。也就是说，在前列腺癌中通常被DNA拷贝数改变的基因，只在同一前列腺内的多个肿瘤中受到异常影响。此外，当对DNA拷贝数数据进行无监督的分层聚类时，来自同一患者不同病灶的样本不倾向于聚类在一起。

结论：

一、这项研究通过使用高覆盖度的全外显子组测序，首次大规模表征了多灶性前列腺癌肿瘤中体细胞突变的异质性。

二、遗传异质性是前列腺癌中最常见的表现，而不是一种罕见的情况。在点突变和 DNA 拷贝数改变方面，在同一前列腺内的多个肿瘤中很少发现相同的突变。因为来自一个肿瘤病灶的信息不能转移到存在的其他病灶。

三、揭示了与先前发表的论文相当的突变频率，其中包括每个患者的单个肿瘤。

四、与不表达融合基因TMPRSS2-ERG的样本相比，表达融合基因 TMPRSS2-ERG 的样本通常在得分最高的基因中几乎没有体细胞突变。

五、该研究还揭示了很大程度的病灶内异质性，反映了肿瘤生长过程中突变的持续积累，或者看似一个肿瘤病灶，实际上是两个或多个合并肿瘤病灶的结果。

六、同一前列腺内的多个肿瘤中发现的突变很少影响已知的癌症关键基因。

小编点评：

这项研究通过使用高覆盖度的全外显子组测序，首次大规模表征了多灶性前列腺癌肿瘤中体细胞突变的异质性。这是第一次对明显不同的肿瘤病灶进行此类研究，而不仅仅是同一肿瘤的不同区域，而且是在如此大量的患者中进行的。此文章表明同一前列腺中的绝大多数肿瘤病灶是独立的肿瘤，没有共同的前体，也没有共同的突变谱。这些结果坚定地强调完全的病灶间遗传异质性是前列腺癌中最常见的表现。这些发现对如何实施个性化前列腺癌药物具有重要意义，包括无法进行单个肿瘤活检，甚至无法从同一病灶进行多次活检来预测给定患者的临床结果。因为分析一个病灶的基因型和表型不会提供有关其他病灶的必要信息。因此，候选患者（例如，进行病灶治疗）应在决定治疗前对其前列腺进行彻底活检，是为了排除其他病灶的存在。