Hortic Res|圆叶葡萄染色体水平基因组序列与全基因组关联研究揭示分析12个浆果相关性状的遗传分析

Hortic Res|圆叶葡萄染色体水平基因组序列与全基因组关联研究揭示分析12个浆果相关性状的遗传分析

 导读

       葡萄有两个亚属，真葡萄亚属和圆叶葡萄亚属。圆叶葡萄亚属由M. rotundifolia, M. munsoniana, and M. popenoei三种物种组成，圆叶葡萄作为商业葡萄作物种植。圆叶葡萄原产于美国东南部市场占有比较小，能耐多种病害，如霜霉病、白粉病、皮尔斯病、根瘤蚜等，此外其营养含量高。因以上特性成为重要的经济作物。但目前仅有少量圆叶葡萄亚属育种相关的遗传研究。因此本文为圆叶葡萄亚属物种研究奠定基础，组装了圆叶葡萄变种“诺布尔”（Muscadinia rotundifolia cv.Noble）染色体水平的全基因组序列。基因组全长393.8 Mb，分配到20条染色体上，鉴定了26 394个编码基因。与欧洲葡萄基因组比发现，Muscadinia rotundifolia 基因组较小但有高度保守的基因共线性。全基因组关联研究圆叶葡萄群体的356个体的12个浆果相关性状分析。真葡萄亚属和圆叶葡萄亚属的可转移性标记分析发现，2000个核心基因组的rhAmpSeq标记，实现标记在真葡萄亚属物种间的转移，1599个 rhAmpSeq标记返回到圆叶葡萄亚属的数据。GWAS分析鉴定出与12个浆果相关性状相关的52个QTNs，全基因组和GWAS结果为深入研究圆叶葡萄亚属提供新的依据。

 论文ID

原名：Chromosome-level genome sequence assembly and genome-wide association study of Muscadinia rotundifolia reveal the genetics of 12 berry-related traits

译名：圆叶葡萄染色体水平基因组序列与全基因组关联揭示12个浆果相关性状的遗传分析

期刊：Horticulture Research

IF：6.793

发表时间：2022.1

通讯作者：Islam El-Sharkawy

通讯作者单位：美国佛罗里达农工大学

DOI：10.1093/hr/uhab011

实验设计

研究材料：5年龄的圆叶葡萄新鲜叶片提取总DNA 做全基因组测序组装，

   13个组织(叶片、闭合花、细根、坐果、成熟果实、开放花、花粉、前导物、成熟种子、成熟皮/肉、卷须、版本)RNA-seq测序

   356个个体的提取DNA 做GWAS关联分析

技术方法：Illumina：50.7G（121X）、PacBio：10X 、HI-C、

Illumina RNA-seq：11.9 Gb

实验路线图

结果

   圆叶葡萄亚属基因组测序与比较分析

       无参考基因组分析圆叶葡萄亚属为二倍体，杂合度为1.55-1.58%，单倍型基因组大小为约416.1 Mb。重复序列和唯一序列的总长度分别为144.3(34.7%)~ 271.8 Mb(65.3%)。Hi-C和PacBio测序，得到20条单倍体染色体，总组装长度为393.8 Mb，注释了26394个基因，发现2600个独特基因（M. rotundifolia cv .T rayshed 中无）。与欧洲葡萄基因组（ PN40024）比M. rotundifolia cv . Noble包括1757个特有基因，M. rotundifolia cv . T rayshed 1804个，总体来看圆叶葡萄亚属基因组相似。比较了M. rotundifolia cv . Noble, M.rotundifolia cv . T rayshed、 V . vinifera PN40024共线染色体序列发现圆叶葡萄亚属两个栽培品种中至少10个染色体部分倒置、3个易位和5个带有易位的倒置，表明两个染色体组合中可能有一个存在装配错误或基因组变异。V . vinifera PN40024比 M. rotundifolia cv . Noble 大21%，基因共线性高度保守，但至少有18个部分倒置。V . vinifera的7号染色体在M. rotundifolia中分列成7号和20号。

   Euvitis rhAmpSeq标记对圆叶葡萄亚属种群进行基因分型

       通过对圆叶葡萄亚属基因组染色体水平组装，利用GWAS对圆叶葡萄亚属的性状进行遗传分析，对真葡萄亚属核心基因组开发的2000个rhAmpSeq标记，共有1599个标记在356个个体中显示多态性。经过筛选共有1283个标记，348个个体用于后续分析。与rhAmpSeq标记的一致，1283个标记在圆叶葡萄亚属染色体序列基因丰富区。每条染色体相邻标记间距离分布一致，中间值为120 ~ 250kb，四分位间值为70 ~ 510kb，相邻标记间的连锁不平衡(LD)平均为0.36，其间LD衰减到初始值的一半距离约为2.3 Mb，Euvitis中在11.6和16.6 kb内观察到LD的快速衰减。LD缓慢衰减可能是种群的起源，因为该种群有多个亲本的育种种群组成。ADMIXTURE软件进行参数聚类分析，对k = 1到k = 30的亚种群进行检验，在k = 15时达到最小交叉验证误差，确定最优k值为15，并在后续的GWAS分析中使用该值。

   圆叶葡萄亚属物种12个浆果相关性状的表型分析

       为研究12个性状之间的相关系数用表型数据进行Pearson检验，两组性状呈显著正相关。一组包含可见色、色度和明度3个果实颜色相关性状，相关系数≥0.69。另一组包括长度、宽度、每个浆果的重量和硬度等特征，其长度和宽度呈较强的正相关(r = 0.92)，表明Muscadinia浆果倾向于呈圆形。浆果的硬度与长度、宽度、重量呈正相关(r≥0.54)，表明越大的浆果往往越坚硬，每簇浆果数与果长、果宽、果重呈负相关。

   浆果的长度、宽度、重量、硬度及每簇浆果的数量

       果实长度和宽度上分别检测到8个qtn，有6个是多性状qtn，这可能解释了这两个性状之间的强相关性。6个多效qtn中，chr2_4825658两个性状的PVE均最高，长10.26%，宽13.22%。每粒浆果的重量和硬度上也检测到chr2_4825658 QTN，分别为11.16%和9.41%。其余qtn的PVE≤6.12%。chr2_4825658是四个性状的主要QTN，可以解释它们之间的相关性。chr2_4825658的侧翼标记分别位于第2染色体的4.29和6.72 Mb，两个侧翼标记之间共鉴定出211个基因。每簇浆果的数量显示有3个qtn。在3个QTN中，chr5_5884957的PVE最高，为7.85%，在QTN的侧翼标记间共鉴定出42个基因。

   多位点GWAS方法对12个浆果相关性状的数量遗传分析

       多位点GW AS进行数量性状的遗传分析，测试了mrMLM、FASTmrMLM、 FASTmrEMMA、 pLARmEB、 pkWmEB、 ISIS EM-BLASSO 六种多位点方法共鉴定了52个与12个浆果相关性状相关的QTNs ，26个被多种方法检测到，表明这些QTNs比单一方法检测的QTNs更可靠。6种方法中pLARmEB灵敏度最高，共检测了35个QTNs。

   浆果颜色、色度、明度

       使用三种类型的浆果色进行GWAS:可见色、色度和明度，共检测到9个性状qtn，其中chr4_9358331、chr4_11238026和chr16_23164495 3个是在多个浆果中鉴定到的多效qtn，其中，chr4_9358331和chr4_11238026是3个性状的主要qtn，表型变异率为8.06%-28.15%。浆果色的两个主要qtn在V . vinifera4号染色体上分别为9.36和11.24 Mb。在Muscadinia连锁图谱中，预测浆果颜色位点位于Euvitis 4号染色体上的11.09 ~ 11.99 Mb之间，包括了chr4_11238026的位置。本研究中，与花青素生物合成途径相关的谷胱甘肽s-转移酶(VvGST4)认为是候选基因。为了确定QTN是否与候选基因存在物理关联，研究了Muscadinia基因组中QTN两个侧翼标记之间的注释基因，Muscadinia染色体上侧翼标记9.96 ~ 10.75 Mb鉴定出29个基因。29个基因中鉴定出4个谷胱甘肽s-转移酶基因。4号染色体10.58 ~ 10.61 Mb之间的2个基因与候选基因(VvGST4)核苷酸同源性≥98%，表明浆果颜色性状chr4_11238026 QTN与该性状的已知候选基因存在关联。因此，该基因座对应的chr4_11238026 QTN也希望成为Muscadinia颜色的定性性状基因座。

       使用浆果颜色相关性状的数量表型评分，希望通过这些性状的其他qtn来确定数量性状。该QTN的侧翼标记分别位于Muscadinia4染色体的7.49和7.97 Mb，共鉴定出22个基因。果实颜色的主要QTL为VvMYBA1和VvMYBA2， Muscadinia 2号染色体的19.01 Mb处发现了这些同源基因，本研究未检测到该区域周围的QTN。其他QTL中，只有col-2-2与chr2_6241099的位置相似。col2 -2鉴定出的候选基因为VIT_02s0012g00630，其同源基因位于Muscadinia 2染色体7.46 Mb处，距离chr2_6241099位点约0.35 Mb。在 Muscadinia 2号染色体上，鉴定到chr2_6241099的6.99和8.57 Mb侧翼标记。因此，chr2_6241099 QTN有望与col-2-2为同一QTL。在Euvitis中，除chr2_6241099 QTN外，其余QTN的位置均与之前的结果不同，表明， Muscadinia和Euvitis浆果颜色性状的QTNs不同；因此，圆叶葡萄亚属的浆果颜色可能受不同于Muscadinia的遗传背景的调控。

   Muscadinia葡萄亚属GWAS

       利用Euvitis基因组序列中获得的1283个rhAmpSeq标记对 Muscadinia浆果相关性状进行GWAS分析，rhAmpSeq标记分辨率足够，群体显示出缓慢的LD衰减，一些染色体在基因丰富区含有不包含标记的空块。rhAmpSeq标记在Euvitis种中可转移性为91.9%，在Muscadinia种中可转移性为61.9%。这种差异的部分原因是由于Euvitis 和 Muscadinia之间的遗传距离较远，以及Muscadinia个体亲本的后代组成的多样性较低，Muscadinia种群的低多样性可能与LD衰变有关。，为了实现高效GWAS，开发合适的核心Muscadinia 合集是必要的。对Muscadinia葡萄浆果颜色的两次独立遗传分析结果一致，表明GW AS结果是可靠的。利用6种不同的多位点GWAS方法，可以获得12个Muscadinia相关性状的可靠QTNs。特别是从显著相关性状中鉴定出的多效qtn，为进一步研究控制这些性状的多效基因提供了有力的证据。

结论

        本研究报道了Muscadinia葡萄染色体水平的参考基因组序列，根据组装的染色体序列，M. rotundifolia基因组大小比 V . vinifera约小21%。但两基因组的基因同线性高度保守，利用可转移的分子标记对 Muscadinia葡萄进行多位点GWAS分析揭示了定量性状相关标记鉴定的可靠结果。本研究中所使用的标记的可转移性将为研究Muscadinia 和 Euvitis的比较遗传学提供新的机会，M. rotundifolia的GW AS将有助于扩大对Muscadinia葡萄的研究。

小编总结

       本文组装了M. rotundifolia的染色体水平的基因组，通过比较基因组学分析圆叶葡萄亚属的两个栽培种种的染色体存在多处倒置和易位，从而得出栽培种的染色体可能存在装配错误或基因组变异。采用GWAS关联分析其12个浆果相关性状的遗传，该文GWAS方法采用了6种，从六种种找到了灵敏度最好的PLARmEB法，同时发现当K=15时最适合做关联分析。通过分子标记发现果实长度、宽度、颜色的QTN，并且能准确定位到具体染色体上鉴定处相关基因，最重要的是发现果实的颜色受花青素合成途径相关的谷胱甘肽S-转移酶（VvGST4）/控制。本文通过全基因组合GWAS关联分析对12个浆果相关性状进行了订了分析，并且该结论通过推论认为是可靠的。

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