Plant Biotechnology Journal| IF=9.8柑橘高时空分辨率转录组分析

Plant Biotechnology Journal| IF=9.8柑橘高时空分辨率转录组分析

导论

       柑橘类果实具有独特的结构，果皮柔软，果肉中含有维管束，数个部分带有许多汁囊。每个果实组织的功能和形态各不相同。 因此，器官范围或混合组织水平的分析不可避免地掩盖了许多组织特异性现象。本篇文章采用高通量RNA测序技术，分析了柑橘从幼龄果实到成熟果实的6个发育阶段。通过共表达网络分析，鉴定了组织特异性网络的共表达基因和关键基因模块。特别重要的是，发现柑橘果实发育和成熟过程中植物激素的调控网络。并提出了一个模型来说明ABF2如何介导ABA信号，参与柑橘果实发育过程中的蔗糖运输、叶绿素降解、生长素稳态、类胡萝卜素和ABA生物合成以及细胞壁代谢。此外，本文还详细描述了柑橘果实中蔗糖和柠檬酸代谢相关基因的时空表达模式，并确定了几个可能在果汁囊中蔗糖和柠檬酸积累中发挥关键作用的关键基因，如SWEET15和CsPH8。本篇文章在高空间和时间为柑橘果实发育和成熟的分子网络提供了重要的见解。

论文ID

原名：High-spatiotemporal-resolution transcriptomes provide insights into fruit development and ripening in Citrus sinensis

译名：高时空分辨率转录组为柑橘果实发育和成熟提供了依据

期刊：Plant Biotechnology Journal

影响因子：9.803

发表时间：2021.1

通讯作者：Hualin Yi

通讯作者单位：华中农业大学

DOI：10.1111/pbi.13549

研究材料

       采集50、80、120、150、180和220六个阶段的脐橙，4个果实组织(EP、AL、SM、JS)，每个样本3个生物重复，共72个样本。

技术方法

       Illumina HiSeq 4000 测序平台RNA序列分析，HPLC-ESI-MS/MS 平台激素分析，使用CIELAB颜色系统(CR-400)测量果皮的颜色指数(CI)。采用气相色谱气相色谱(GC)法测定果浆的可溶性糖和有机酸浓度，用便携式折射仪(PAL-1，ATAGO)和自动电位滴定仪(916Ti-Touch，Metrohm)测定果浆的总可溶性糖(TSS)和总酸(TA)，定量实时PCR（qRT-PCR）表达分析，果肉的荧光原位杂交以及双荧光元素酶测定。

研究结果

1.解剖果实组织转录组的全局分析

       除AL_2_1和AL_3_1外，每个样本的所有三个生物重复都聚集在一起。对于AL、SM和JS组织，将以下样本聚类在一起：第1和第2阶段；第3和第4阶段；第5和第6阶段。在第1阶段和第2阶段，组织间的差异小于各阶段间的差异，而在第3阶段和第6阶段，组织间的差异大于两个阶段之间的差异。计算每个基因的归一化读计数(每千碱基的转录本序列每百万碱基对测序的片段，FPKM)。在16 621 (JS6)~19 455 (EP1)基因之间，每个FPKM值均大于0.3，其中85%以上的基因在1~100FPKM范围内。将来自同一组织的所有六个阶段的基因结合起来，并使用维恩图来揭示果实组织中特有或共同表达的基因。4个果实组织中共有18 156 个共同基因。在这四种组织中，EP具有最多的组织特异性基因。

图1 果实组织的收集和果实转录组的全局分析

       为了鉴定每个组织中柑橘果实发育过程中不同的基因表达趋势，我们使用STEM进行聚类。结果表明，在EP、AL、SM和JS中分别鉴定出11、13、11和7个具有统计学意义的基因表达趋势（彩色图）。在这四种组织中，发现了两种特殊的趋势模块（趋势8，下调；趋势39，上调）。维恩图显示，在图谱39和图谱8的4个果实组织中，特有表达基因的数量均多于共同表达基因的数量，表明在果实发育过程中，每个果实组织存在不同的调控网络。KEGG通路富集分析结果表明，与柠檬酸循环、蛋白酶体、丙酮酸代谢和类胡萝卜素生物合成途径相关的基因上调比下调的基因更多。在39_JS中，柠檬酸循环途径中富集的基因含量达到所有柠檬酸循环途径基因的51%（23/45），表明随着柑橘果实的发育，JS的TCA循环持续增强。

图2 各果实组织的基因表达谱分析和功能富集分析

2.共表达网络分析揭示了脐橙果实组织发育中存在不同的调控过程

       四个组织中3个特有模块（蓝色，2462个基因；紫色，313个基因；和黑色，442个基因）被进一步分析。对蓝色、紫色和黑色模块的三个基因集进行GOterm富集分析。在蓝色模块(EP特有)中共表达的基因在“脂质代谢” 、“对镉离子的反应”和“类黄酮代谢”的生物学过程中显著富集(图3b)。在紫色模块(AL和SM特有)中，基因在“韧皮部或木质部组织发生”、“运输”和“对有毒物质的反应”的生物过程中显著富集(图3e)。黑色模块(SM和JS特有模块)的基因主要参与了“翻译”、“核糖体生物发生”和“蛋白质转运”的生物学过程(图3h)。为了进一步识别这些模块中的关键调控基因，使用WGCNA和Cytoscape来构建和可视化基因网络，其中每个节点代表一个基因，基因之间的连接线（边缘）代表共表达相关性。在网络中连接最多的枢纽基因可能是关键的调控基因。在蓝色、紫色和黑色的模块网络中，512个基因中的20个，152个基因中的18个，134个基因中的12个分别编码转录因子(TFs)(图3c、f和i)。CsAPL是紫色模块网络中具有最多边数（98条边）的hub基因(图3f)。在其他模块网络中，高度连接的TFs包括CsKAN2(Cs3g09270)、CsERF13(Cs1g03290)、CsMYB5(Cs9g03070)和CsTT8(Cs5g31400)。（图3c、f和i）。

图3 组织特异性基因的表达谱、功能和网络图

       在之前的研究中、ABA、茉莉酸(JA)和二3乙酸(IAA)在果实发育和成熟中发挥重要作用。测量了6个发育阶段各果实组织中ABA、IAA和JA的含量(图5a、c和e)。通过WGCNA测定了模块与植物激素之间的关联。如图4a所示，ABA与绿色模块(r2=0.74，P=3e-05)高度相关，JA与黄色模块高度相关(r2=0.88，P=1e-08)。所有模块均未与IAA高度相关。绿色模块中共表达的基因在“细胞大分子分解代谢”、“渗透胁迫反应”和“细胞内运输”中显著富集(图4b，c)。在黄色模块中，这些基因在“对伤害的反应”、“有机物质代谢”和“对刺激的反应”中显著富集。此外，在棕色模块中，这些基因在6个发育阶段的所有四个组织中持续下调或上调，主要参与“对化学物质的反应”、“纤维素代谢”、“细胞死亡”和“细胞壁组织”的生物过程（图4f，g）。

图4各阶段特异性基因的表达谱、功能及相关性

3. 激素相关基因表达的时空分布

       参与生物合成、运输、分解代谢和偶联的基因共同调控各果实组织中ABA的含量。PP2C8/51、SnRK2.1/2.4/2.8和ABF2(图5b)。表明，这些基因可能在柑橘果实发育过程中对ABA有响应。ABF2(Cs3g23480)是ABA信号转导模式中的最后一个基因。EP和JS可能是生长素的合成位点，然后再被运输到其他果实组织中。推测GH3.1可能在IAA的稳态中发挥重要作用。JA在柑橘果实发育和成熟过程中主要在EP和AL中发挥作用。

图5果实发育和成熟过程中四种果实组织中ABA(a)、IAA(c)和JA(e)水平的动态变化，以及主要ABA-(b)、生长素-(d)和JA相关基因(f)在不同组织和不同阶段的表达变化

4. 柑橘糖酸积累关键基因的挖掘

       果肉中的可溶性糖从80DAF开始迅速积累，从155DAF开始适度积累。SWEET15在SM和JS中特异性高表达，SWEET10在SM中特异性高表达。此外，SWEET10和SWEET15的表达水平随果实发育而逐渐上调。可溶性糖和表达是一致的。采用荧光原位杂交方法来表征SWEET15在JS中的表达模式。SWEET15在JS的表皮细胞中表达。

图6 柑橘类果实中糖积累相关基因的表达

       在有机酸方面，果肉中柠檬酸含量在发育早期显著增加，在80DAF时达到峰值，从80-220DAF时逐渐减少，苹果酸含量在80DAF时达到峰值，在120DAF时下降，从155DAF时略有增加。奎宁酸的含量不断下降，在220DAF时几乎为零。挖掘了与柠檬酸和苹果酸转运相关的基因，在所有果实组织中，大部分H+atp酶基因随着果实发育的增长而逐渐上调。其中，CsPH8(AHA10)在SM和JS中特异性表达，在JS中高表达。分析了CsPH8在4个不同柑橘品种(‘Succari’, ‘Bingtang’, ‘Xinhui’ and ‘Newhall’) 中的表达情况；这些品种的柠檬酸含量变化很大。CsPH8的表达与柠檬酸的含量高度相关。为了进一步鉴定参与柠檬酸和苹果酸代谢调控的关键基因，我们构建了JS组织的基因表达调控网络图。

图7 柑橘类果实组织中酸积累和阶段相关基因的表达

5.外源性ABA类似物促进柑橘果实成熟

       外源ABA类似物AM1的对柑橘果实发育的影响。AM1显著促进了柑橘果实色素、叶绿素降解和糖积累(图8a-d)，降低了果皮和果肉中IAA的含量(图8e)；AM1介导的蔗糖积累促进尤为显著（图S8)。此外，我们使用qRT-PCR对不同途径中的许多基因进行了量化，包括IAA偶联(图8f)、细胞壁代谢(图8g)、类胡萝卜素生物合成、ABA信号转导(图8h)、叶绿素降解(图8i)和糖转运途径(图8j)。ABF2、RRCR、SWEET15和GH3.1等多个基因的表达被AM1大量上调（图8）。这些结果表明，ABA对柑橘果实的发育和成熟至关重要。

图8 ABA类似物促进柑橘类果实的发育和成熟

6. ABF2在柑橘成熟过程中ABA信号转导中起着重要作用

       ABF2是介导ABA信号传递的关键基因。鉴定了几个与ABF2共表达的基因，并且在启动子中包含至少有一个Aba响应的顺式元件(CACGTG或ACGTG)(图9a)。这些基因包括类胡萝卜素和ABA生物合成基因(PSY、Z-ISO、NCED1/2/4)、叶绿素分解代谢基因(HCAR、PAO、RCCR、PPH和NYC1)(CCEs)、糖转运体基因(SUT4、SWEET10/15/16)、IAA结合基因(GH3.1)和果实增大和软化相关基因(Expansin-A1/A8)。ABF2与这些基因之间的相互作用通过酵母单杂交(Y1H)检测或双荧光素酶检测得到了进一步的验证(图9b，c)。

图9 与ABF2相互作用的基因。

       根据转录组数据和验证分析，提出了一个模型来说明ABF2在柑橘果实中介导的ABA信号调控网络。在该模型中，ABF2起着主导作用，参与调控蔗糖运输、叶绿素降解、生长素稳态、类胡萝卜素和ABA的生物合成以及果实的增大和软化。

图10 提出的ABA信号传导和蔗糖积累的模型

结论

（1）转录组的空间和时间分辨率数据对柑橘发育和成熟提供了重要的见解；

（2）识别几个组织特有模块和关键TFs；

（3）在柑橘水果发育和成熟网络互作分析，发现了ABA和生长素信号之间的相互作用；

（4）识别关键基因参与蔗糖积累和柠檬酸代谢。

小编点评

       本文亮点是采用了全面的二维组织和阶段收集和深入的RNA-seq数据集使高分辨率的基因组规模分析成为可能。本研究在每个果实组织中发现了许多组织特有基因，这可能是导致四种果实组织之间差异的原因之一。识别几个组织特有模块和关键TFs；在柑橘水果发育和成熟网络互作分析，发现了ABA和生长素信号之间的相互作用；识别关键基因参与蔗糖积累和柠檬酸代谢。美中不足的是这种介导关系的结果都是仅基于基因表达数据获得的，因此，还需要进一步的基因功能研究。

       文献链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13549