Cancers经典案例 | 单细胞转录组在肿瘤微环境中的研究应用

CAF亚群分类的新发现--癌症微环境的可能影响

原名：Single-Cell Transcriptomic Analysis of Tumor-Derived Fibroblasts and Normal

Tissue-Resident Fibroblasts Reveals Fibroblast Heterogeneity in Breast Cancer

译名：单细胞转录组学分析肿瘤源性纤维细胞与正常组织驻留纤维细胞在乳腺癌中的异质性

期刊：Cancers

IF：6.639

发表时间：2020, 12

通讯作者：Aimy Sebastian

通讯作者单位：Physical and Life Sciences Directorate, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore

DOI：10.3390/cancers12051307

导读：

1，肿瘤相关纤维细胞（CAFs）是实体瘤中一种重要的基质细胞类型。

CAFs分泌的分子在肿瘤的进展和转移中起着重要作用。在此过程中具有潜在不同生物学功能的异质群体。

2，炎症细胞和MHC II类细胞表达CAF谱在正常乳腺/胰腺组织中也检测到，表明这些表型不受肿瘤微环境诱导。

3，这项工作增强了我们对CAF异质性的理解，特别针对这些CAF亚群可能是一种有效的治疗高度侵袭性TNBC（乳腺癌）的基础。

实验设计：

材料：

       4T1细胞购自ATCC（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。4T1-Thy1，1细胞系作为朱利安·卢姆博士的礼物提供。4T1-Thy1。1细胞表达Thy1的非天然亚型，Thy1.1（CD90.1），与天然亚型Thy1.2（CD90.2）相差一个氨基酸。mT3细胞系是从KPC小鼠PDAC病灶中分离出的类器官发展而来的。细胞系是通过免疫活性C57BL/6小鼠的同源性肿瘤形成。

       注射10周龄雌性BALB/c小鼠（美国ME巴尔港Jackson Laboratories）注射量为25000个4T1或4T1-Thy1。细胞，Matrigel比例1:1 的悬浮液和磷酸盐缓冲盐水（PBS）混合进入乳腺脂肪垫（MFP）建立肿瘤。注射后19-26天对小鼠实施安乐死，肿瘤是从这些老鼠身上解剖出来的。单细胞悬浮液是通过将肿瘤穿刺制备得到。

方法：

       使用Cell Ranger单细胞软件执行样本解复用、条形码处理和单细胞基因计数。使用带有默认参数的“cellranger mkfastq”与小鼠基因组（mm10）对齐。 进一步分析使用Seurat软件包。首先，筛选出每个细胞检测到的基因少于500个少于5个细胞表达的细胞和基因。超过7800被测基因的细胞被剔除。死细胞通过保留线粒体读数小于5%的细胞排除。移除所有数据集中不需要的单元格，我们通过使用全局缩放规范化来规范化数据方法选用“LogNormalize”。主成分分析（PCA）使用之前确定的2000个可变基因。之后绘制 K-最近邻（KNN）图。可视化降维（UMAP）使用前15个主要维度。在4T1中共确定了12个分群。

结果分析：

1，UMAP降维聚类分析

       6420个细胞符合的质量使用Seurat进行聚类确定了12个细胞簇。然后利用umap进行可视化的降维。其中4被确定为CAF。

2，差异表达基因表达量分析

       挑选之前发表过的markers基因。簇0、2、3、5、7、8和9中的细胞表达CD45（Ptprc）。免疫细胞占所有测序细胞的66.4%。簇4中的细胞具有高水平的Thy1、Pdpn和Pdgfra。并被确定为CAF。该集群包括535个细胞，占约8%的分析细胞。高水平表达Epcam（簇1和簇6）的簇被确定为上皮/癌细胞，并占约24.5%。簇10中的细胞表达高水平的Pecam1和Mcam确定为内皮细胞。我们还发现了少量周细胞（簇11）。根据Thy1，周细胞和CAF可能存在相似的表达标记物。

       鉴定了大量显著富集于CAFs的基因与其他聚类类型相比。CAF已被证明在细胞外矩阵（ECM）合成和组织。4T1派生的CAF胶原蛋白（Col1a1、Col1a2、Col3a1、Col5a1-3、Col6a1-3等）、蛋白聚糖（Dcn、Lum、Bgn、Prg4等）和糖蛋白（Postn、Dpt、Tnc、Fbln、Fbn1等），与这些功能一致。CAFs也表达了高水平的参与胶原加工和组装成纤维的几种酶，如图F。

3，CAF细胞亚群再聚类分析

       在约4000个测序细胞中，我们检测到上皮细胞（Epcam+），内皮细胞（Pecam1+）、周细胞（Mcam+、Rgs5+）和低水平免疫细胞（CD45+）；这些聚类组从后续分析中排除。

       对于CAF无监督聚类，结果有六个不同的簇具有独特的基因表达特征。

       图B中的是原始的区分CAF的特征基因均高表达。

4，细胞拟时序分析

       利用Monocle进行细胞轨迹分析。簇0（LY6C1高）中的细胞为分布在轨迹的一端，而簇1中的细胞（α-SMA/Acta2high）位于另一端，表明这些簇彼此之间的差异最大（图2E，F）。假时间分析还表明，来自簇2的分裂/循环细胞（Cdk1high）包括从Ly6c1high和Acta2high簇分化的细胞。簇3（CD53高）细胞沿着轨迹存在。簇4（Crabp1high）位于Ly6c1high簇旁边，而簇5（Cd74high）细胞主要分布在轨迹的另一端，更靠近α-Smahight簇。

5，亚群差异基因表达分析

       α-SMAhigh簇显示多种生长因子基因的富集，包括转化生长因子β（Tgfb1和Tgfb2）、结缔组织生长因子（CCN2/Ctgf）、胎盘生长因子（Pgf）、血管内皮生长因子a（Vegfa）和Wnt5a。这些增长因素参与癌症发展和进展的各个方面，包括细胞增殖，迁移、侵袭、EMT和血管生成，提示α-SMA高CAF可能促进肿瘤成长与进步。

       CD53高表达的簇细胞显示胞质中间丝蛋白结蛋白（Des）的显著转录富集对肌肉的结构完整性和功能起着至关重要的作用。其他基因在该簇中富集的包括基质糖蛋白纤维连接蛋白，其在成熟的肿瘤发展和进展中起作用。

       膜胶原蛋白Col4a1、Col4a2、Col18a1、层粘连蛋白A2（Lama2）和Mmp19，据报道可降解多种基膜蛋白，都在Crabp1high集群中富集。

       Cd74high簇中的单元唯一表达高水平的MHC II类基因（H2 Aa、H2-Ab1、H2 Eb、Cd74等），通常由抗原呈递细胞表达（图3F）。该簇还表达了常用的CAF标记物，如Pdpn、Pdgfra、Thy1、Col1a1、Col3a1和Dcn，其水平与其他CAF簇具有相似性。再次确认这些Cd74high细胞是CAF而非免疫细胞。

       正常乳腺脂肪垫细胞和4T1成纤维细胞的比较分析肿瘤源性CAFs显示，来自肿瘤的LY6C1高CAFs具有高分子相似性来自正常乳腺脂肪垫的LY6C1高成纤维细胞，表达常见标记物如Ly6c1、Clec3b、Dpt、Ly6a、Htra3、Has1和Col14a1（图S5A、E）。然而，转录本编码细胞因子Cxcl12和Il33在肿瘤源性CAF中的表达显著增高，提示肿瘤微环境诱导该亚群中这些基因的激活。其他CAF亚型标志物的表达主要局限于肿瘤。

结论：

1，4T1乳腺和mT3胰腺同源的scRNA序列分析研究TNBC和PDAC肿瘤类型的CAF异质性。研究确定了六个TNBC中具有不同基因表达谱的CAF亚型。

2，乳腺癌与胰腺肿瘤源性CAF显示肌成纤维细胞样CAF、炎性CAF和MHCII类表达的CAF在两种肿瘤类型中具有相似的分子图谱。

3，炎症成纤维细胞和表达MHC II类的成纤维细胞是健康组织，表明这些成纤维细胞亚型不是由肿瘤微环境诱导的，可能在肿瘤发展过程中被纳入到肿瘤中。

小编点评：

      这是一篇肿瘤方面的单细胞文章，分析内容全面，细致。在充分的利用前面已发表论文的基础上，对于CAF细胞群继续分类，得到了比以往更多的亚群，并分析了这些细胞亚群的微环境对于癌症的影响。并观察到了某些亚群与正常细胞存在一定程度上的类似表达。