拟南芥细胞图谱探索细胞代谢的冗余性和多功能性

拟南芥细胞图谱探索细胞代谢的冗余性和多功能性

原名：Distinct identities of leaf phloem cells revealed by single cell transcriptomics译名：单细胞转录组学揭示叶片韧皮部细胞的异质性

期刊：Plant Cell

IF：11.277/Q1

发表时间：2021，5

通讯作者：Ji-Yun Kim

通讯作者单位：

Institute for Molecular Physiology and Cluster of Excellence on Plant Sciences (CEPLAS), Heinrich-Heine-University Düsseldorf, Düsseldorf 40225, Germany.

DOI：10.1093/plcell/koaa060.

导读：

       研究人员以6周龄拟南芥成熟叶片为材料，富集了拟南芥叶片中的维管细胞，鉴定了至少19个细胞群，包括表皮细胞、保卫细胞、吐水细胞、叶肉细胞以及各种其他维管细胞类型，并且通过通路富集分析明晰了各类细胞发挥的功能作用和参与的代谢通路。具有韧皮部薄壁细胞特征的细胞群高表达转运蛋白相关基因，比如SWEET11和SWEET12（蔗糖和鲜味氨基酸）外排载体基因。作者发现韧皮部薄壁组织的发育独立于韧皮部分化必需的转录因子APL。韧皮部薄壁细胞具有独特的氨基酸代谢模式，该模式与伴胞（CC）的代谢模式明显不同，这就解释了叶脉中差异的氨基酸分布或代谢水平存在差异的原因。维管细胞的单细胞聚类分群结果与叶脉传统形态学的细胞分类吻合，只是伴胞（CC）与包括韧皮部薄壁细胞（PP）在内的其它维管细胞有明显的分化。综上，本文所报道的拟南芥叶片维管组织单细胞转录组分析为叶片的维管以及叶片不同细胞类型之间的关系提供了广泛的信息。

实验设计：

材料：

       从6周龄的成熟叶片中分离出原生质体在短日照（8小时光照/16小时黑暗）条件下生长的拟南芥Col-0植株。对于原生质体分离。移除远轴表皮、保卫细胞和毛状体。每边都有两处切口，用剃须刀片剥下的叶子的主脉，然后分离提取。进行了两次生物重复，每次捕获约7000个叶片原生质体细胞。单细胞试剂盒遵循v2协议scRNA序列文库测序是在NextSeq平台。

方法：

       Cell Ranger 3.0.2进行表达量分析。Seurat R用于降维分析。SCTransform选项用于规范化、缩放数据和使用默认参数查找可变基因。在标准化过程中，由于线粒体定位百分比引起的变化被移出。没有过滤具有较高rRNA转录水平的细胞，因为rRNA水平可能因细胞而异。在所有聚类分析中阈值为0.8。UMAP降维使用10个主成分、30个相邻成分进行二维可视化。再分类使用相同的参数。对于相关性分析，分析聚类内细胞的平均表达，并计算皮尔逊相关系数。

结果：

1，细胞聚类结果

       从富含脉管的叶片原生质体群体中产生了5230个单细胞。每个细胞平均表达3342个基因，总计表达了27159个转录本。使用Seurat的无监督聚类确定了19个不同的细胞簇。这19个簇覆盖了叶片的所有主要细胞类型。以叶肉细胞为主（占75%），已知叶肉的富集表明

       标记物（CAB3、LHCB2.1和CA1）。这个叶肉群由12个簇组成并在UMAP地块上形成了三大分支。

        发现簇4含有束鞘（BS）和木质部细胞，随后再分类得到三个细胞亚群，C4.1、C4.2和C4.3。亚群C4.2和C4.3为富集BS标记SCL23和硫酸盐转运体SULTR2。C4.2富含参与光合过程的基因，可能表明BS细胞分化。两个BS集群的存在性与形态学描述一致。C4.1、C10、C15和C18，总计478细胞被指定为维管细胞类型。

2，与韧皮部和木质部相关的PC再分类

拟南芥原形成层是一种双面干细胞。近轴极产生木质部的种群和远轴极韧皮部。XP簇就在簇10附近。第10簇可进一步细分为三个子簇：PP1（C10.2）和两个不同的PC簇，C10.1.1和C10.1.2。而PCPP中的单元格对应于PC参与维持分生组织特性的细胞并且促进韧皮细胞分化，PCXP细胞出现与木质部细胞的形成有更密切的关系，并且更靠近XP群集。

3，PP簇的分析

       与运输过程相关的许多转录本在PP簇中特别富集，这可能表明它们受相同转录网络的控制。鉴定了多个亮氨酸拉链基因（bZIP），它们都是PP簇的特异性基因（bZIP6、bZIP7、bZIP9），或存在于PP和其他簇中。我们能够确认bZIP9启动子活性对PP具有特异性。GUS活性强也在已知参与质外运输步骤的细胞类型中检测到。bZIP9的特异性与转运过程中靶基因的激活跨越不同的组织。然而，如前所述，bzip9单突变体没有表现出表型差异与野生型（WT）植物相比，并且PP标记物的转录水平没有显著变化在bzip9突变体中。

4，CC簇的分析

       CCs富含各种转运体的转录物，包括氨基酸/H+转运体AAP2FTIP和APL等基因，钾通道KAT1，六糖单转运蛋白SWEET1和SWEET4，以及液泡膜肽转运蛋白PTR4/NPF8.。所有这些标记也在CC翻译体中富集。CC中的一个细胞子集专门用于合成FT，FT是一种小的可移动蛋白质。

5，PP和CC细胞不同的代谢通路分析

UMAP中PP和CC明显分离，并表明存在不同的分化途径。MYB螺旋型转录因子APL对韧皮部特性的定义起着关键作用。APL优先表达在CC中，但也在PCPP中检测到。因此有两个假设：（i）APL是所有韧皮细胞或（ii）PP独立于SE/CC发育，区别是apl突变体的特征是CC标记物SUC2急剧减少，但apl保留了多个PP标记；在apl突变体中，PP标记转录本甚至高出4倍。如前所述，apl中PPmarker转录物的增加是否是由于apl抑制PP分化的代偿机制所致。对于木质部分化而言，仍有待进一步研究阐明。

6，PP和CC的独立性和互补性的代谢研究

CC和PP的PAS值在氨基酸生物合成和降解方面都有显著差异路径。而生物合成的途径的氨基酸在CC、PP簇的较低显示代谢活性升高。簇C18，表现出酸（ABA）、乙烯、茉莉酸（JA）和赤霉素（GA）等激素途径的高活性，以及BS和XP簇（C4）和两个簇（C10和C18）的硫苷生物合成活性富集。

7，胞间连丝的细胞类型特异性表达蛋白质

PDs是连接植物细胞、可能的运输溶质、代谢物、小RNA和蛋白质的的高度复杂的通道。不同类型的细胞有独特的PD类型。发现PD基因的转录本，如PLAMODESMATA定位蛋白（PDLP）和多个C2域和TRNAMEMBRANE区域蛋白（MCTP）s在细胞中表现出不同的表达模式。PDLPs的细胞类型特异性与其系统发育关系相关。我们的数据支持PD类型特定装配的概念。

结论：

对于PP再分类得到簇10.2的和18.1，提供对PP簇转录组的跟深入的见解。除了sweets基因外，scRNA seq还提供深入了解其他PP富集的基因，特别是识别UmamiT氨基酸转运体家族。UmamiTs是一种非选择性转运蛋白，参与细胞需要氨基酸的流出。SWEETs和SUTs似乎是一对一负责蔗糖从PP流出，另一个是主动导入SE/CC细胞。这之间可能存在一条有选择性的代谢通路过程。

激素代谢因细胞类型而异。负责激素生物合成在很大程度上是未知的。该分析的代谢提供了一个图谱，可以指导确定叶片中激素的生物合成和运输途径。由于大多数转运物显示出功能冗余和不同的底物特异性，该数据集可作为来源鉴定细胞类型特异性冗余家族成员，以产生多个突变体，消除或验证交互对，并确定未知的运输工具。

确定了PP在激素生物合成和防御上的生物学反应。本研究中的信息为制定影响离子、代谢物和信号流量的策略提供了关键资源。

文章亮点：

该实验成功的研究了拟南芥的叶片细胞，并通过对维管细胞的再分析获得了转录表达有显著差异的三个子类群，丰富了拟南芥的单细胞图谱。文章注重研究了三个子类群在细胞转运上的差异，探讨了潜在的氨基酸代谢模式。为更进一步的讨论维管细胞的转运机理奠定了基础。