NC丨产甲胎蛋白胃癌(AFPGC)的全外显子组测序揭示了基因组谱和治疗靶点

发布日期：2022-06-17 浏览次数：2566

作者：Jun Lu；

【作者和通讯作者单位】： 浙江大学医学院附属第一医院肿瘤外科;

杂志：NC，IF：14.919

产甲胎蛋白胃癌(AFPGC)的全外显子组测序揭示了基因组谱和治疗靶点

摘要：

产生甲胎蛋白的胃癌（AFPGC）是一种罕见的侵袭性胃癌亚型，其特点是肝转移率高，预后极差。对AFPGC进行全外显子组测序分析，鉴定出34个显著突变的基因。体细胞拷贝数改变分析揭示了几个显著的局灶扩增(如19q12, 17q12)和局灶缺失(如1p36. 11,9p21.3)，其中一些对患者的预后有负面影响。比较分析表明，AFPGC具有与TCGA（癌症基因组图谱）胃癌以及其四种分子亚型不同的基因组特征。在 AFPGC 中鉴定了几个具有潜在治疗靶点的经常改变的基因。进一步分析显示19q12扩增CCNE1和/或17q12扩增ERBB2的AFPGC生存率较低，侵袭性更强。随后，基于我们建立的患者来源的AFPGC异种移植模型，进行了转化研究，并验证了靶向CCNE1和ERBB2的治疗价值。在这项工作中，我们提供了对AFPGC的基因组特征的理解，并提出了一个平台来探索和验证基因组指导的个性化治疗该疾病。

材料和方法

全外显子测序材料： 58个（详细请参考结果内容一）；

试剂盒：安捷伦SureSelect人类全外显子V6试剂盒

参考基因组：GRCH37

测序： HiSeq 2500，PE150

比对：BWA（v0.7.8）

变异获取（SNV）： MuTect

插入缺失(InDel)：Strelka

变异注释： ANNOVAR (ANNOVAR_2015Mar22)

DNA拷贝数分析：CNVkit(0.9.9)和GISTIC 2.0

突变基因筛选： MutSigCV v1.4(SNV和InDel，FDR<0.05)

替换特征： SomaticSignatures

KEGG通路富集： DAVID bioinformatics Resource 6.8

数据库使用：COSMIC、OncoKB数据库、msc – impact等。

参考基因组：GRCH37

H&E 和 IHC 染色

荧光原位杂交

蛋白质印迹

建立PDX模型

统计分析

结果

一、患者和肿瘤样本

机构共诊断了5261例GC病例，然后纳入了105例AFP IHC阳性的GC患者队列(补充图1)。其中，符合标准的 58 对FFPE肿瘤组织和邻近正常组织进行了WES。

1）105例AFPGC患者中，男性79例(75.2%)，诊断时中位年龄64岁(范围:30-83岁)。

2）大多数(68.6%)患者被诊断为晚期(I/II期33例，III/IV期72例)。

3） 42例(40%)患者发现肝转移。

4）与本研究所分期匹配的非AFPGC患者相比，AFPGC患者预后较差(危险比(HR) = 1.47,P = 0.015)(补充图2a)

5）血清AFP水平高(>270 ng/mL)的患者总生存期(OS)较差(P = 0.017)(补充图2b, c)。

二、AFPGC的体细胞突变和特征

1）比对效率

对58例GC肿瘤和匹配的正常组织的基因组DNA进行WES分析，平均覆盖率分别为161倍和105倍(补充数据2)。

2）体细胞变异(SNV和InDel)

共鉴定出1041个体细胞单核苷酸变异(snv)和300个体细胞插入缺失(indel)，包括1179个同义突变和161个非同义突变，对应于目标DNA每MB有4.08个非同义突变(补充数据3)。

1) 通过MuSic分析，在AFPGC中发现34个显著突变基因(图1a和补充表2)。其中，AFPGC中最常见的突变基因为TP53(69%)、PCLO(21%)、CSMD3(19%)和KMT2C(19%)。

4) 此外，还检测到LRP1B、SYNE1、FPR1、PRDM1和PRKRIR等频繁突变基因(>9%)。值得注意的是，TCGA-GC中频繁突变的驱动基因(如PIK3CA、KRAS、APC)在AFPGC中很少发生突变(图1b和补充数据4)。 AFPGC中TP53突变频率明显高于TCGA-GC (P < 0.01)。

5) 此外，与TCGA亚型相比，AFPGC的TP53突变率明显高于TCGA- cin以外的所有亚型(图1c和补充数据4)。

6) 详细分析显示，AFPGC检测到的64.3%的TP53突变发生在dna结合结构域，包括反复出现的错义突变R273H/C、R272M、R282W(图1d)。此外，3例AFPGC中存在寡聚结构域的剪接位点突变c.994-1 G>A(X331_splice)，而TCGA-CIN或TCGA-GC中不存在(补充图3)。相反，TCGA-CIN中最常见的突变TP53 R175H/G在AFPGC中未见。此外，AFPGC和TCGA-CIN对KMT2C、MDC1、FPR1、EPHA1、SMAD4等其他突变显著的基因的突变率也存在差异(图1c和补充数据4)。

7）主要体细胞突变类型为C:G>T:A transitions和C:G>A:T transversions(补充图4)。共筛选出3个独立突变标记(图1e和补充数据5)。

8) 其中，Signature 1表现出与时钟样突变过程相关，并与年龄相关。在从有咀嚼烟草习惯的人身上提取的癌症样本中发现了29号特征。第17号标志是食道癌和胃癌的标志。重要的是，Signature 6(与有缺陷的DNA错配修复相关)的循环模式被发现缺失，这与AFPGC中未发现MSI病例的结果一致(补充数据6)。

这些突变标记在AFPGC中对各种临床病理特征的贡献如图1f所示，并没有观察到显著的相关性(补充图5)。

三、AFPGC体细胞拷贝数的改变

1）共有58对AFPGC肿瘤和正常样本使用GISTIC 2.0进行体细胞拷贝数改变(SCNAs)分析。结果：SCNAs在AFPGC中反复出现，包括CCNE1 (19q12)、ERBB2 (17q12)、CCND1 (11q13.3)、MUC4 (3q29)、MCL1 (1q21.3)和MYC (8q24.21)扩增，以及ARID1A (1p36.11)、CDKN2A (9p21.3)、CREBBP (16p13.3)和SMAD4 (18q21.2)的缺失(图2和补充数据7)。

2) 此外，通过Kaplan-Meier生存分析探讨了SCNA对AFPGC生存结果的影响。结果显示：(a)19q12或17q12扩增的患者OS率可能显著低于未扩增的患者(19q12, P = 0.008;7q12, P = 0.038, Supplementary Fig. 6)。

(b)此外，扩增8q24.21的患者预后较差(P = 0.112)。

3) 进一步比较AFPGC和TCGA-GC的显著SCNA(补充图7)。在AFPGC中共发现92个显著SCNA区域(42个扩增，50个缺失)，其中58个区域(22个扩增，36个缺失)在TCGA-GC中不显著。提示AFPGC具有相对特异性(补充图8a, b)。

4）考虑到AFPGC具有较高的TP53突变率和SCNAs数量，我们随后将AFPGC的SCNAs与TCGA-CIN (TCGA-GC中已知的SCNAs复发亚型)进行比较，发现只有AFPGC中存在57%(24/42)显著扩增和74%(37/50)显著缺失(补充图8c-f)。如7q11.21、6p21.33和19q13.43的扩增，9q34.3和1p36.32的缺失(补充图7)。这些区域包含重要的癌症相关基因，包括TRIM28、SEMA3C、NOTCH1和FAT1。

四、通路分析

1）体细胞突变和SCNA数据通路分析，发现AFPGC的核心信号通路改变，包括RTK/RAS/PI(3)K、p53/细胞周期和JAK/STAT(图3和补充数据8)。

(a) RTK/RAS/PI(3)K信号通路主要由ERBB2、ERBB3和MYC的扩增改变。

(b) P53/细胞周期信号通路的改变主要是由于 TP53 的频繁突变和编码细胞周期蛋白的 CCNE1/CCND1 的扩增。

(d) 与TCGA队列(TCGA-GC)中GC相比，AFPGC和TCGA-GC均富集了RTK/RAS/PI(3)K和p53/细胞周期信号通路的改变，但模式不同。

(e) 在RTK/RAS/PI(3)K信号通路中，AFPGC显示ERBB2重复扩增和突变。RAS/PI(3)K信号通路的关键组分kras、PIK3CA和pten在TCGA-GC中频繁突变，而在AFPGC中不存在。

(f) 在p53/细胞周期通路中，细胞周期介质(如CCNE1、CCND1和CDK4/6)在AFPGC中频繁激活，而在TCGA-GC中激活程度明显较低。与TCGA-GC相比，AFPGC中TP53突变较多，但上游介质(ATM/ATR/EP300)和DNA修复调控因子(BRCA1/2)突变较少。

五、潜在靶基因的比较分析和生存分析

1) 根据AFPGC的基因组改变，已知的癌症相关或潜在靶向基因中有许多改变，包括ERBB2(31%)、CCNE1(29%)、MYC(22%)、CCND1(16%)、MCL1(14%)、FLT1(12%)、ERBB3(10%)、AURKA(10%)、AXL(9%)、BCL6(9%)、BRCA2(9%)、EGFR(9%)、ERBB4(9%)、FGFR2(9%)等，这些改变与TCGA数据库的数据有一定的可比(图4a)。

2) ERBB2和CCNE1在AFPGC中变化率最高(31%和29%)，显著高于TCGA队列中的变化率(19%和13%)(补充表4,P值< 0.05)。总的来说，潜在靶基因(前5个)的基因组改变发生在整个AFPGC样本的74.1%(图4b)。

3) ERBB2和CCNE1分别是17q12和19q12中两个众所周知的致癌基因，在一个更大的临床样本中，我们通过FISH或IHC检查了ERBB2和CCNE1的状态(N = 105，图4c)。AFPGC中ERBB2阳性率明显高于TCGA-GC及亚型(图4d和补充表5)。

4) 在CCNE1中也观察到了类似的趋势。进一步探讨了ERBB2和CCNE1对105例AFPGC患者的预后价值。结果显示，与AFPGC阴性患者相比，ERBB2或CCNE1阳性患者的生存结果更差(HR = 2.07, P = 0.009，图4e;HR = 2.64, P < 0.001，图4g)。然而，在TCGA亚型中ERBB2和CCNE1扩增最频繁的TCGA-cin队列中没有发现这种现象(图4f, h)。

5) 此外，评估了AFPGC中ERBB2和CCNE1与临床病理特征的关系(补充表6)。ERBB2阳性与肿瘤-淋巴结转移(TNM)进展期(P = 0.035)、淋巴血管侵犯阳性(P = 0.033)、高肝转移率(P = 0.025)相关。这些发现表明 ERBB2 或 CCNE1 的扩增可能有助于 AFPGC 中的肿瘤进展。

6) 为探讨ERBB2和CCNE1对预后的联合影响，将105例患者按照ERBB2和CCNE1的状态分为三组(联合阳性组:ERBB2和CCNE1阳性;单阳性组:ERBB2阳性或CCNE1阳性;共阴性组:ERBB2阴性、CCNE1阴性)。有趣的是，共阳性组表现出最差的OS率和侵略性的生物学特征(图4i)。

六、PDX模型中潜在治疗靶点的验证。

1) AFP、ERBB2和CCNE1的状态通过FISH和/或IHC确认(图5a和Supplementary Fig. 9)，图5b-d为不同ERBB2和CCNE1状态的AFPGC PDX模型的代表。每种PDX模型的临床病理特征和详细变化汇总在补充表8和补充图10中。

2) CCNE1及其催化亚基细胞周期蛋白依赖激酶2 (CDK2)在G1-S相变的调控中起着关键作用。

靶向CDK2已被证实是治疗CCNE1扩增型肿瘤的一种有效的抗癌策略。评估AZD5438 (CDKs抑制剂，包括CDK2)在CCNE1扩增或不扩增的5种AFPGC PDX模型中的疗效。结果显示，在CCNE1扩增的AFPGC PDX模型中，对照组与AZD5438处理组的肿瘤体积有统计学差异，而在非CCNE1扩增的模型中无统计学差异(图5e-h)。

2) CCNE1及其催化亚基细胞周期蛋白依赖激酶2 (CDK2)在G1-S相变的调控中起着关键作用。

3) 评估了曲妥珠单抗的抗肿瘤活性。与之前发表的报告一致，曲妥珠单抗在ERBB2阳性AFPGC PDX模型中发挥抗肿瘤作用(图5i, j)。

4) 此外，AZD5438 和曲妥珠单抗的抗肿瘤活性在 ERBB2 阳性 PDX AFPGC 模型上进行了评估。根据之前的研究，CCNE1的扩增或过表达参与了乳腺癌对曲妥珠单抗治疗的耐药性。有趣的是，在ERBB2和CCNE1共扩增的PDX模型中，AZD5438联合曲妥珠单抗治疗组与单独使用AZD5438或曲妥珠单抗治疗组的肿瘤体积也存在统计学差异，但在CCNE1非扩增的PDX模型中未观察到上述结果(图5i-k)。

5) 给药后，在ERBB2和CCNE1共同阳性的PDX模型中，通过western blotting分析进一步评价处理效率(图5l)。结果表明，AZD5438通过抑制CDK2和磷酸化的视网膜母细胞瘤(p-Rb)的表达发挥抗肿瘤作用。与其他组相比，曲妥珠单抗联合AZD5438治疗组中p-ERK、p-AKT、CDK2和p-Rb的表达明显降低。

结论

1、本文了解了AFPGC的临床病理和分子特征，并专注于可靶向的基因组改变。

2、证实AFPGC有较高的肝转移率和较差的预后。

3、研究揭示了AFPGC发生和发展的频繁基因改变和关键信号通路。

4、分析了 AFPGC 中潜在的可靶向基因，并进行了转化研究，以探索针对该疾病的 PDX 模型的精确靶向治疗。

小编点评：

与普通 GC 相比，AFPGC 与更激进的行为和更差的预后相关；迄今为止还没有专门的治疗方法，也缺乏大规模的基因组研究。本研究通过全外显子组测序(WES)、荧光原位杂交(FISH)和免疫组化(IHC)对AFPGC患者进行了AFPGC的分子图谱分析。确定了几个可能具有靶向性的经常改变的基因，并构建了一系列的PDX模型，为AFPGC的潜在分子靶点识别和治疗方法优化提供了平台。

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