客户文章丨通过线粒体基因组比较分析进一步了解小麦S型细胞质雄性不育的机制
发布日期：2022-06-28 浏览次数：3810
导 语
小麦(Triticum aestivum L.)是世界上分布最广、产量最大的粮食作物之一。面对日益增长的人口需求和消费，可持续和有效的方式增加全球小麦产量至关重要。杂种优势使遗传多样性个体的杂交后代表现出比亲本更好的产量、抗逆性和育性。目前，杂种优势已应用于水稻、玉米、油菜、大豆等作物。小麦是自花授粉植物，其杂交育种需要阻断自花授粉，可通过遗传雄性不育、光热雄性不育、化学药剂或细胞质雄性不育等途径实现。细胞质雄性不育( CMS)是高等植物中普遍存在的一种现象，它是由于细胞核和细胞质之间复杂的相互作用而发生的，表现为母性遗传、花粉衰竭和正常雌蕊小麦雄性不育的研究已有很多，然而S型CMS与线粒体基因组之间的相关性仍不明确。本文对小麦CMS细胞系的线粒体基因组进行测序，并与保持系比较发现CMS线粒体基因组编码26个tRNAs, 8个rRNAs和35个蛋白编码基因，以及编码蛋白基因发生突变的复合体III的cob，该蛋白质会影响活性氧(ROS)的产生。ROS代谢分析表明，不育系统中抗氧化剂和抗氧化酶的缺乏加剧了膜脂氧化，导致活性氧积累，影响花药发育，因此cob认为是CMS的一个候选致病基因序列。
实验设计
研究材料：新鲜叶片
技术方法：CTAB 法提取DNA 二代&三代测序建库、代谢检测
实验路线图
结果
S1376A细胞学观察
KI-I2染色法测定花药育性。1376B的花粉粒富含淀粉，不育系花粉粒中不含淀粉(图1a)，说明不育系S1376A完全流产。为了确定花药时期，用醋酸品红染色发现当穗刚抽出但未完全抽出时，花药处于无核期(图1b, f)，当头部完全出芽时，花药处于双核期(图1c, g)，当头部完全出芽一段时间后，花药处于三核期。
S1376A线粒体基因组组装特征
S1376A线粒体基因组为单环状，长度为452,638 bp, GC含量为44.36%，AT偏度0.001,GC偏度为0.002；共鉴定出69个基因(表1)，其中tRNA基因26个，rRNA基因8个(rn5(3)、18(3)、26(2))，蛋白编码基因35个。蛋白质编码基因有多种功能;1个成熟酶基因(matR)， 1个转运膜蛋白基因(mttB)， 9个复合体I基因(nad1- 7,9,4l)， 1个复合体III基因(cob)， 3个复合体IV基因(cox1-3)， 7个复合体V基因(atp1, 4,6(2)， 8(2)， 9)， 4个细胞色素c基因(ccmB, ccmC, ccmFN, ccmFc)， 9个核糖体蛋白基因(rpl5,16, rps1,2,4,7,12 - 14)。其中，rn26、rps3和rps19为假基因;这三个假基因可能是基因家族转化过程中形成的无功能残基，无法转录到正常mRNA中，从而无法表达。研究发现2634个ORF为CDS，其中1327个为正向编码，1307个为反向编码，长度大于300 bp的ORFs有82个；blast揭示了7个具有高同源性。特别是，orf1637 与Aegilops tauschii Coss脂肪酰辅酶 A 高度相似，而 orf499 与玉米叶绿体中也高度相似的核糖体蛋白 S7，在 S1376A 中，有 84 个独特的 ORF，其中 42 个正向，42 个是后向。 只有 orf1079、orf2232、orf2650、orf342 和 orf958 大于 300 bp； 然而，注释和比对表明它们不编码蛋白质。
PCGs的RSCU分析
s型CMS线粒体基因组中有31个密码子RSCU > 1 ，说明这些密码子在基因组中优先使用，编码天冬氨酸的密码子AGA值最高，RSCU为1.55，其次是异亮氨酸密码子CAU, RSCU值为1.54。优先使用的密码子中以U结尾的密码子16个，以A结尾的密码子12个;另外三个密码子中的两个以C结尾，一个以G结尾。
重复序列
基因组中有9个大重复序列，序列长度≥500 bp，相似性大于90%。最长序列长度为9882 bp，相似性为99.98%。最短序列长度为1362 bp，相似度为90.05%。4个重复序列的相似度为100%，长度分别为7035、5469、2045、1634 bp。散在重复只有两种形式，即正向重复序列和反向重复序列。两种类型的重复序列只有少数在40 bp以上，80-89 bp (F:2, P: 5)和90-99 bp (F:1, P: 4)之间的重复序列最少。最长的正向散在重复，长度为7035 bp，编码两个rrn26基因。其他的序列多在30 ~ 39 bp之间(F: 99, P: 95)。30 bp的散在重复序列中20个正向，29个回文。49个散在重复序列编码8个基因（2个nad7、2个nad4(内含子)、2个rps3(内含子)、1个cox1、1个ccmC和46个基因间间隔(IGS)）。
S1376A与1376B共线性分析
S1376A和1376B的两个基因组均未发生序列倒置和重排，仅基因位置和类型略有差异，表明这两种小麦的序列具有良好的共线性和高同源性，基因类型和位置差异需要进一步分析。
S1376A和1376B中indel和snp的识别
s型CMS和保持系发现了46个InDels和303个snp，InDels分布在39个orfs和3个PCGs (cob, nad1, nad2(内含子))中。只有 13 个 SNP 编码基因：cox3 2个，matR 的1个，nad4（内含子）1个 ，rps4 1个，trnF 1个，trnS 2个，nad7（内含子）2个， trnW 3个。印度花椰菜的细胞质遗传变异与snps和indels有关,认为s型CMS株系的遗传变异也可能与303个snp和46个indel有关。
PI值为0.00067，多态位点数量为302个，其中，211个片段具有核苷酸多样性;最大值为0.0725，占29个多态位点，最小值为0.0025，占134个多态位点。
S1376A、1376B Ka/Ks分析
蛋白质编码基因cob、rps4和cox3 Ka值分别为0.0016、0.0011和0.0032，cob和matR的Ks分别为0.0065和0.0025。只有cob存在非同义突变和同义突变，Ka/Ks值为0.24 < 1，表明在进化中受负选择压力。负向选择穗轴是否能诱导花粉败育，还需要在s型CMS系和保持系上验证。
生理指标分析
检测了ROS主要来源发现S1376A和1376B的H2O2含量在单核阶段和双核阶段存在显著差异，S1376A双核阶段的H2O2含量比1376B更多。S1376A和1376B中O2−的含量仅在双核阶段存在显著差异，S1376A中各阶段O2−的含量均较高。S1376A和1376B中MDA的含量在三个阶段均有显着差异，S1376A中H2O2积累较多。
花药中的 SOD 活性在 1376B 和S1376A 降低。双核和三核阶段，1376B的SOD活性显著高于S1376A。同一时期不同品种花药中POD活性差异显著，S1376A增加，1376B降低，CAT活性存在显著差异，双核阶段 S1376A 和 1376B 花药以及 CAT双核阶段 1376B 的活性显着高于 S1376A。双核期，1376B中ASA和GSH含量显著高于S1376A。APX活性在双核期显著高于S1376A，其他各期差异均显著。单核和双核阶段，1376B的GR活性显著高于S1376A，MDHAR活性在双核阶段显著高于S1376A。总之S1376A抗氧化物质含量不足，抗氧化酶活性较低，尤其是在双核期。
结 论
本研究组装了S-CMS不育系线粒体基因组，长 452,638 bp，编码 69个基因，长重复序列长度为40400 bp，散在重复序列长度为60563 bp，分别占mtDNA的8.9%和13.4%。重复序列的总长度远低于k型CMS。不育系与保持系序列共线性，同源性较高。CMS和保持系比较分析发现有46个InDels(39个orfs和3个基因)和303个SNPs(13个基因)；Ka/Ks分析表明只有cob基因同时存在同义突变和非同义突变。本研究发现小麦S型雄性不育系线粒体cob基因受负选择，通过序列比对发现该基因的一个序列中插入了多个碱基，导致了密码子的移位和终止密码子后移，推测这可能与小麦s型CMS表型有关。研究发现双核阶段s型CMS系中H2O2和MDA含量显著高于1376B，说明S1376A中积累了ROS。研究发现S1376A花药中抗氧化物质含量不足，抗氧化酶活性低，导致ROS和MDA的积累。这些结果表明，ROS代谢可能与雄性不育有关，尤其是在双核期。然而，这一现象是否与cob突变有关还有待进一步确定。
小编总结
本文通过测序组装注释了小麦线粒体基因组分析其基因组特点，同时与保持系1376B做比较基因组学分析，发现cob基因受负选择，他们共线性和同源性很高。通过序列比对找到了cob基因中插入了多个碱基，导致了密码子的移位和终止密码子后移，推测这可能与小麦s型CMS表型有关。同时又通过生理实验对双核和三核阶段的ROS代谢物H2O2和MDA、O2- 等含量进行检测进一步证明ROS代谢可能与雄性不育有关，尤其是在双核期。本文从组学测序和生理代谢两方面研究S型雄性不育机制，推断引起不育的基因和对应的INDEL 位点。该文章从客户开始做到送样测序组装注释分析然后到拿到数据写文章投文章整个周期大约为14个月，凸显了植物线粒体基因组产品周期短，成本低见刊快的特点。
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