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原名：Ribonuclease H-like gene Small Grain2 regulates grain size in rice through brassinosteroids signal pathway

译名：核糖核酸酶H-like基因Small Grain2通过油菜素内酯信号通路调控水稻籽粒大小

发表期刊：Journal of Integrative Plant Biology (JIPB)

IF:9.106

发表时间：2022年7月

合作单位：南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室

DOI： https://doi.org/10.1111/jipb.13333

导读

提高水稻产量是保障国家粮食安全的重要途径。水稻粒径由粒宽、粒长和粒厚决定，是决定水稻产量的关键性状。油菜素内酯（brassinosteroids, BRs）是一类多羟基化的甾醇类植物激素，广泛参与植物生长发育的各个过程，如株高、叶夹角和分蘖等，尤其在调控水稻籽粒大小方面发挥着重要作用。

OsGSK2/GSK2是拟南芥BRASSINOSTEROID INSENSITIVE2 (BIN2)的同源基因，属于糖原合成酶激酶3 (GSK3)/ SHAGGY-like激酶家族。GSK2通过控制细胞的增殖和扩张，在调节粒径方面起着核心作用。因此，识别新的GSK2相互作用因子将有助于丰富我们了解GSK2控制粒径和粒形的分子机制。

OVATE家族蛋白(OFPs)是植物特异性蛋白，含有一个保守的OVATE结构域，在调节植物生长发育如株高和粒级等方面发挥重要作用，一些研究称OsOFPs调节植物激素信号和生物合成途径，尤其是BR通路。但OFPs如何结合BRs信号通路调控籽粒大小的分子机制还有待进一步研究。

许多因素来协调BR的生物合成途径和粒度调控。然而，这些调控因子之间的关系和分子机制尚不清楚，需要进一步研究这些调控因子如何共同介导BR信号转导和调控颗粒大小。

材料与方法

研究材料：sg2突变体是在宁靖1号水稻愈伤组织培养中获得的。从水稻突变体数据库(RMD) (http://rmd.ncpgr.cn/)中获得sg2-1 (RMD_04Z11EM07) T-DNA插入突变体。sg2-1突变体和Gi (GSK2-RNAi)的野生型为ZH11。slg-D的野生型来自DJ。

技术方法：sg2与9311(籼稻)杂交F2群体。

为鉴定SG2基因，将sg2与宁粳1号杂交获得F2群体。

从25株具有sg2突变表型的F2植株中提取等量的DNA构建隐性混池；由25株F2野生型植株的等量DNA构建显性混池。Illumina HiSeq2500平台进行全基因组重测序MutMap分析。

突变体+qRT‑PCR +表型观察+扫描电镜+光学显微镜+转基因+胁迫处理+GUS染色+荧光互补实验+荧光素酶互补成像+pull-down+体外激酶检测+酵母双杂+亚细胞定位+基因敲除+表型鉴定+转录组测序

结果

*01

sg2突变体具有多效性缺陷，sg2小穗壳细胞变小

本研究作者通过组织培养诱导突变体文库筛选，获得一个小粒和半矮秆表型的小粒突变体，命名为 sg2 (small grain2, sg2)。与野生型相比，sg2突变体的籽粒长、粒宽和千粒重分别下降了14.97%、6.40%和23.54%(图1D - G)。结果表明SG2是株高、穗型、粒度和粒重的多效性调控因子。组织学分析表明，突变体sg2的籽粒变小是由于小穗壳的细胞扩张被抑制所致。

                                                                               SG2影响植物的形态和颗粒大小

*02

SG2的克隆及互补分析

从sg2突变体中分离突变基因，将突变体与野生型杂交，得到F2群体进行遗传分析。F1植株表型与野生型相似，在F2群体中，野生型和突变型的表型比例接近3:1(野生型218株，突变型82株;cχ2 = 0.871,p > 0.05)。以上结果表明，sg2表型受单隐性基因控制。

通过图位克隆，从sg2突变体和9311(籼稻)杂交中获得F2群体。在31株具有sg2突变表型的F2个体中sg2位点被限制在2号染色体标记S3和S7之间的9.4Mb区域(图S2A)。该区域与MutMap分析的预测一致(图S2B)。基于全基因组重测序分析，在突变体sg2的9.4Mb区域只检测到编码区1个indel，且∆(SNP/ indel)指数大于0.67 (T able S1)。序列分析发现，在sg2突变体中LOC_Os02g25230外显子包含一个8bp的缺失，导致帧移位和提前终止。因此，我们以LOC_Os02g25230作为候选基因。

                                                                              图位克隆与mutmap结果

对这一假设进行检验，从RMD (http://rmd.ncpgr.cn)中获得了一个插入T- DNA载体产生的LOC_Os02g25230的第一个外显子的T-DNA突变体，并将其命名为sg2-1。该sg2-1突变体的表型与sg2突变体相似。在突变体中加入8.4 kb的野生型基因组DNA片段，包括sg2的编码区、4071 bp的启动子区和1990 bp的下游区域，得到sg2-com植株。阳性转基因植株在表型上与野生型植株形态、粒大小和粒重相似(图2B-F)。

我们还利用CRISPR/Cas9方法在野生型(宁粳1号)中对SG2进行了敲除，获得了sg2功能缺失转基因植株，表型分析证明，其株高降低，籽粒大小和粒重降低(图2G-L)。系统发育分析显示，SG2属于植物特异性蛋白家族，分为双子叶组和单子叶组，且sg2属于单子叶组。综上所述，这些结果支持了SG2基因为LOC_Os02g25230的预测。

                                           sg2基因的克隆及sg2 -com株系和sg2 CRISPR突变体的表型分析

*03

SG2在BR信号响应中起正向调节作用

为了了解SG2在转录水平调控上的作用，对野生型和sg2突变体的1周龄幼苗进行了RNA-seq分析。共鉴定出518个DEGs，在二萜类生物合成、MAPK信号通路和内质网蛋白加工等通路中显著富集。二萜类生物合成相关基因显著下调，GAs相关基因OsGA20ox1、OsKSL10和OsYABBY4发生明显变化，这一数据表明，SG2可能主要参与GAs合成或信号通路。因此，在外源GA3处理下，sg2突变体与野生型相似。因此，内源GAs水平的降低可能是导致半矮化表型的原因。但SG2在BR信号通路中的作用目前尚不清楚。在这里，我们发现sg2在BR信号通路中起正向调节作用，其突变导致外源性BR处理不敏感(图3A-D)。

sg2突变体对BRs的敏感性较低

BR含量影响sg2的基因表达和蛋白丰度(图3E-G, S9)。此外，外源BRs还能分别增加水稻幼苗和烟草叶片细胞中SG2-GFP的丰度，促进细胞核中SG2-GFP的积累(图3E, 5A)。以上结果表明，sg2-like蛋白参与GA、IAA和BRs等多种植物激素通路，并可能作为整合这些通路的开关，调控植物生长发育。因此，在未来的研究中，需要明确核糖核酸酶H-like结构域对SG2-like蛋白分子功能的影响。

*04

sg2与GSK2相互作用并被GSK2磷酸化，且在核质中的分布受GSK2的调控

发现新的GSK2互作蛋白将丰富我们对籽粒大小控制的分子机制认识。本研究发现，sg2是籽粒大小的正调控因子。生化实验和遗传分析表明，sg2是GSK2下游控制籽粒大小的新因子(图1、2、4、6和S12)。此外，在水稻原生质体中，当sg2与活性GSK2共表达，而与激酶死亡的GSK2K92R共表达时，sg2蛋白在细胞质中存在较多 (Figure 5C, D, F–H)。这些数据表明，OsGSK2磷酸化sg2可能调控其亚细胞定位。

                                                                  图4.GSK2与sg2相互作用、磷酸化

                              sg2的核质分布受GSK2调控

*05

SG2在遗传上作用于GSK2的下游，调控籽粒大小

为了探究SG2和GSK2在粒度调控方面的遗传关系，首先在野生型中使用CRISPR/Cas9敲除GSK2。在其他农艺性状不变的情况下，两个纯合子株系的粒长和粒宽均增加(图6A-E)。这些结果表明，GSK2对籽粒大小具有重要的调节作用。通过CRISPR/Cas9方法敲除sg2突变体中的GSK2。在植物形态上，cr-gsk2 sg2双突变体与sg2相似，与野生型和cr-gsk2系有明显区别(图6F)。cr-gsk2系粒长增加，但在cr-gsk2 sg2双突变体中，增加的粒长被强烈抑制，且cr-gsk2 sg2双突变体的粒长比野生型短(图6G-H)。cr-gsk2系比野生型粒宽，但cr-gsk2 sg2双突变体的粒宽与sg2突变体相似(图6I)。综上所述，这些结果表明SG2作用于GSK2的下游，拮抗GSK2对颗粒大小的调节作用。

sg2在基因上作用于GSK2的下游

*06

SG2与OsOFP19相互作用

通过酵母双杂交实验筛选sg2和BR信号组分在细胞核中的相互作用(图7A)。结果发现，sg2与OsOFP19相互作用，但不与DLT、RLA1、OsBZR1、GS2或GAMYBL2相互作用(图7A)。通过BiFC、LCI和半体内pull-down实验进一步证实了sg2和OsOFP19的相互作用(图7B-D)。

SG2与OsOFP19相互作用

为了研究SG2与OsOFP19的遗传互作，采用CRISPR/Cas9方法敲除宁晶1和sg2突变体中的OsOFP19，OsOFP19敲除系命名为cr-osofp19，其籽粒长度增加(图8A-D)。籽粒长度的差异可能与遗传背景有关，也可能与验证模式不同有关。转录组和遗传分析表明，与GSK2和OsOFP19相比，SG2在调控潜在共靶向基因表达和籽粒大小方面起相反的作用。

                                                             SG2和OsOFP19在粒度控制中起部分拮抗作用

作者提出了一个SG2如何与GSK2和OsOFP19相互作用以协调BR信号响应和粒度调控的模型。当野生型不存在BRs时，GSK2磷酸化SG2以保留更多的SG2在细胞质中，SG2蛋白水平保持较低。同时，转录复合体OsBZR1-RLA1-DLT的活性被GSK2抑制。当野生型中存在BRs时，GSK2的活性受到抑制，而BRs增加了SG2蛋白的丰度。更多的SG2蛋白与核内OsOFP19相互作用可能释放OsOFP19对BR信号转录复合体的抑制作用。最后，转录复合物的活性被增强以产生正常的籽粒大小。在sg2突变体中，没有功能性的SG2蛋白来释放OsOFP19对BR信号传导的抑制，最终导致籽粒变小。

                                                                                       SG2的籽粒大小调节模型

结论

本研究，作者分离到一个水稻突变体，命名为sg2 (small grain2)，表现为小粒和半矮秆表型。组织学分析表明，突变体sg2的籽粒变小是由于小穗壳的细胞扩张被抑制所致。随后，采用基于图位克隆结合MutMap方法，作者克隆了该基因SG2，发现它编码一个具有核糖核酸酶H-like结构域的植物特异性蛋白。进一步发现，SG2是GSK2应答BR信号通路的正向下游调控因子，其突变导致植物对外源BR处理不敏感。遗传实验和生化分析表明，GSK2与SG2相互作用并磷酸化。BRs可增强细胞核内SG2的积累，且SG2的亚细胞分布受GSK2激酶活性的调控。此外还发现，籽粒的负调控因子OsOFP19可与SG2互作，通过拮抗SG2来实现对基因表达和籽粒大小的调控作用。

集思慧远与万老师团队已合作多次，祝贺万老师团队文章节节高。我们一起总结下本篇精华。在本篇文章中，作者从突变体中通过图位克隆结合MutMap的方式发掘到了目标基因SG2，集结了突变体+qRT‑PCR +表型观察+扫描电镜+光学显微镜+转基因+胁迫处理+GUS染色+荧光互补实验+荧光素酶互补成像+pull-down+体外激酶检测+酵母双杂+亚细胞定位+基因敲除+表型鉴定+转录组测序大套餐揭示SG2是GSK2相关的BR信号应答的一个新因子，通过与OsOFP19互作来调控籽粒的大小。