一文足矣！高质量植物RNA唾手可得！

       细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类，不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白，DNA等杂质，最终获得高纯度RNA产物的过程。

一、植物RNA提取的原理（胍盐/表面活性剂法）

     1、细胞在变性剂异硫氰酸胍/盐酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；

     2、高浓度的异硫氰酸胍/盐酸胍能抑制RNase的活性；

     3、一定浓度的阴离子型、阳离子型、非离子型表面活性剂的配合使用，能溶解膜蛋白、破裂细胞、释放核酸，还具有一定的去污、助溶能力；

     4、漂洗过程中可选择使用DNaseⅠ除去基因组DNA。

二、植物RNA提取的流程及注意事项

     1、样本前处理：

   ①、选择新鲜、幼嫩的植物组织； ②、选择生长旺盛的植物组织。③、液氮研磨或者低温匀浆。

   Q1：样品量是否越多越好?

   A1:不是。在试剂盒规定内增加，若过度增加样品处理量会影响RNA得率；如增加样品起始量，则后续实验中各溶液量均要相应按比例增加;如果遇到难提取的多糖多酚物种，可以相应增加裂解液用量，适当减少样品投入量。

   Q2：如何保证研磨过程和匀浆中RNA不被降解？

   A2：研磨过程要迅速，同时尽量避免外源RNA酶污染；匀浆过程中一定要保证组织和裂解液充分接触，尽量在匀浆前将组织低温切割成小块加入裂解液中，可确保RNA不被降解；处理样品的工具、器皿要尽量保证是无酶的。

     2、细胞裂解：

   ①、用涡旋仪涡旋样品，打散细胞、裂解细胞； ②、涡旋好的样品，室温放置10分钟左右，使之充分裂解。

     3、RNA纯化及获得：

   ①、使用硅基质吸附柱过滤掉组织碎片、高盐低pH值结合核酸、低盐高pH值洗脱核酸； ②、当核酸与硅基质吸附柱结合时，用蛋白漂洗液除去蛋白残留，选用DNaseⅠ除去基因组DNA，用盐离子漂洗液除去盐离子残留。③、用无酶水洗脱RNA（RNA在低盐高PH条件下被洗脱）。

     4、植物RNA提取流程图：

     5、RNA的完整性及纯度鉴定：

   ①、完整性：通常情况下，RNA可用琼脂糖凝胶电泳检测完整性。如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（条带边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上。我们认为RNA的质量较好，否则表示RNA出现降解。出现弥散片状或者条带消失表明RNA降解严重。

   ②、纯度：OD260表示核酸的吸光度、OD280表示蛋白质的吸光度、OD230表示其他杂质（多糖、胍盐等）的吸光度；当1.9 < OD260 /OD280< 2.2时，表明RNA较纯且没有蛋白污染；当 OD260 /OD280> 2.2时，表明RNA可能有降解；当OD260 /OD280< 1.9时表明可能有蛋白质污染。

   注：做三代全长转录组的RNA质量要求比较高（RNA完整性要好，RIN值≥8.0,OD260 /OD280 =2.0-2.2,OD260 /OD230 =1.8-2.1）

    6、RNA的保护：

   ①、提取前保护：

取好的植物样品需要液氮速冻后再放入超低温保存；RNA提取工作区RNase的清除（用除RNase试剂喷洒擦拭，配合紫外灭菌）；实验耗材、器皿的RNase清除（可使用0.1%DEPC水浸泡，再灭菌）。

   ②、提取过程中的RNA保护：

最好使用液氮研磨的方式破碎组织；组织样和裂解液按照合适比例加入；实验员正确的操作（稳、准、狠）和必要的防护。

   ③、实验后保护：

提取好的RNA放入超低温冰箱分装保存，避免反复冻融。

     7、特殊植物组织RNA提取：

   ①、对于多糖含量比较高的组织，需要适当提高裂解液的比例，同时减少组织样的投入量，并增加涡旋时间；

   ②、对于一些含水分特别多的果肉组织，可使用冷丙酮脱水后再加入裂解进行提取实验；

   ③、对于淀粉含量比较多的植物组织（马铃薯块茎、各类植物种子），可用盐酸胍配制的裂解液提取，用异硫氰酸胍配制的裂解提取效果不佳；

   ④、对于一些中药材的RNA提取，一般都会有蛋白污染，提取后需进行进一步纯化实验（按照提取简易流程再操作一遍即可）。