​New Phytologist丨草莓属线粒体基因组研究揭示该属物种结构上进化迅速，序列上进化缓慢，经常发生微倒位的多核苷酸突变

导语

       草莓是倍受人们喜爱的浆果类水果，也是最为年轻的驯化作物之一。我国草莓野生种质资源较为丰富，西南地区是草莓属的分化中心之一。草莓属植物存在广泛的种间杂交与多倍体化，使得其细胞器基因组起源、核质互作演化等方面的研究仍存在很大程度的未知，也阻碍了草莓野生种质资源的有效评估与利用。 遗传多样性的形成与维持机制是进化基因组学的核心问题之一。相对于叶绿体基因组江华而言，植物线粒体基因组一般具有结构复杂多样、替代速率较低、重组频繁等特点，被认为是研究基因组结构与功能演化的重要遗传系统。早期的研究表明，植物线粒体基因组的结构变化非常快，但序列水平的变化却很慢。然而也有学者认为，线粒体基因组编码区和非编码区可能存在不同的选择压或突变修复机制，从而导致这两个区间的演化速率存在差异。 为了更好地理解植物线粒体基因组演化特征与机制，中国科学院昆明植物研究所朱安丹专题组和李德铢专题组完成了13个草莓属野生种完整的线粒体基因组组装，并对其编码区与非编码区序列变异特征进行了深入研究。

     论文ID原名：Fragaria mitogenomes evolve rapidly in structure but slowly in sequence and incur frequent multinucleotide mutations mediated by micro-inversions 译名：草莓属线粒体基因组在结构上进化迅速，在序列上进化缓慢，经常发生微倒位的多核苷酸突变

     期刊：New Phytologist

     IF：10.323

     发表时间：2022.06.22

     通讯作者：李德铢

     通讯作者单位：中国科学院昆明植物研究所

     DOI： 10.1111/nph.18334

实验设计

     研究材料：新鲜叶片

     技术方法：CTAB 法提取DNA 二代测序建库

实验路线图

结果

13个完整草莓属线粒体基因组及其外群

       为研究植物线粒体基因组序列差异，组装了13个草莓属物种的基因组，平均覆盖深度为747-9552X，草莓属线粒体基因组大小变化范围为 1.3 倍，从 F. orientalis 的 275.2 kb 到 F. iturupensis 的 351.2 kb。基因组大小的变化是由于重复序列和 MIPT的谱系特异性积累。F. iturupensis和 F. iinumae是两个最大的线粒体基因组具有最多的重复（36.4 和 8.9 kb），富含 MIPT 序列（16.3 和 19.3 kb）。然而草莓属物种特异性大重复（>500 bp）相对罕见，F. iinumae、F. nubicola 和 F. pentaphylla 各有一个大重复序列（分别为 3325、1029 和 1251 bp），而 F. iturupensis 有三个大重复序列（713、6991 和 8000 bp），它们各自的基因组都是特异的。 只有 F. orientalis 和 F. viridis 共享一个长度为 858 bp 的大重复序列。

       13 个完整的草莓属线粒体基因组基因和内含子几乎相同， 29-30 个独特的PCGs、19 个内含子（14 个顺式、 5 个反式剪接）、3 个 rRNA 和 19 个 tRNA。sdh4 基因是 F. iinumae 的假基因。 除了几个物种的长度略有减少，内含子和编码区的总长度在物种之间高度保守；GC 含量也高度保守（45.0-45.3%），属于被子植物线粒体组的典型特征。此外，草莓属线粒体全基因组核苷酸序列同一性平均为 98.3% - 99.98%，表明该属的序列差异很小，为研究全基因组突变率和模式提供了基础。为了做草莓系统基因组比较，组装了薇甘菊线粒体基因组，长 422,985 bp 的环状图谱，有 31 PCGs、3 个 rRNA 、 20 个 tRNA，与草莓属序列同一性约 95.2% 。

线粒体非编码位点构建草莓系统发育

       筛选168,203 bp的同源间序列推断草莓属线粒体系统发育。系统发育树有很高的支持度（94-100% ），F. iinumae、（F. iturupensis、F. chiloensis）作为剩余采样物种的姐妹进化枝的中等支持（75% ）。该结论与二倍体草莓属基因组数据研究一致，都认为 F. iinumae 是 F. chiloensis 和 F. iturupensis 的二倍体祖先，但与叶绿体数据估计的结果略有不同。

草莓属线粒体基因组中非编码区核苷酸替换率和同义位点相似

       系统发育背景下草莓属线粒体基因组基因间、内含子、编码区的同义和非同义位点。基因间树、内含子树和同义树的核苷酸序列差异水平相似，同义树的单个分支长度比基因间树及内含子树更多变。相反，序列差异在编码时似乎较低特别是在非同义树。基因间树、内含子树和同义树，根到根尖的中间分枝长度是非常相似的，但非同义树和编码树要低 3-5 倍。相对比值判别法未能反对基因间序列和四倍简并位点之间的比率比例，表明这两个数据集之间存在平行比率模式。假设草莓的冠群年龄为 6.37 Ma，基因间区域根尖替代率范围为 0.11-0.50 x 10-9SSB，内含子区域为 0.05-0.36 SSB，同义位点为 0.09-0.61 SSB，编码区仅为 0.04-0.23 SSB，非同义位点为 0.01-0.15 SSB。由于 F. iinumae 和 F. iturupensis 和 F. chiloensis 的分支谱系特异性速率加速，草莓属物种之间的替代率明显不同。

       尽管各谱系间的替代率存在差异，但各分支特异的替代率在基因间区域与同义位点和内含子区域之间几乎一致。同义分歧 (dS) 与基因间区域的速率估计非常相似，而内含子区域的序列分歧略低于基因间区域。然而非同义位点和整个编码区域累积的点突变较少，这可能是由于对部分非同义位点的强纯化选择。

草莓属线粒体基因组中常见的多核苷酸取代和逆转

       人工检测三个或三个以上核苷酸同时变化的多核苷酸替换，他们取代范围从 3 bp到 18 bp，位置为内含子和基因间区域。但草莓属线粒体基因组编码区中不存在，尽管确定了草莓属和委陵菜属序列两种编码微倒位发生在委陵菜或草莓多样化之前。一个属中发现了21个多核苷酸(≥3 bp)替代事件并且已识别的多核苷酸突变（MNM；≥3 bp）都可以反向补充它们的原始状态。一般一对回文序列位于微倒位两侧，表明发夹结构可能通过茎序列之间的重组促进微倒位。这些微倒位介导的MNMs分别占内含子区和基因间区碱基突变的20.5%和4.6%。草莓属线粒体基因组中观察到相邻二核苷酸变化； 双峰替换发生在编码区和非编码区，分别占蛋白质编码区、内含子、基因间区碱基替换的 8.5%、1.7% 和 3.6%。超过一半(51.5%)的二核苷酸变化是反向互补的，通常涉及两种特定二核苷酸TC和GA之间的互反开关。这些反向互补的二核苷酸中有6个被回文序列包围，表明反向互补也可能通过微倒位介导机制发生。突变谱中部分草莓属线粒体基因组核苷酸变化为倒位，编码区、内含子区和基因间区，最常见的碱基替换似乎保持稳定。

多核苷酸替换提高替换率影响系统发育

       植物线粒体基因组中大量的多核苷酸替换，其中许多都是相对于原始状态的反向补充方向(图4A)，并且与回文紧密相关，这强烈表明这些多核苷酸的变化是连锁的、非独立的突变。如果编码区中大量的双重核苷酸以及内含子和基因间区中≥3 bp的突变不是独立的，那么估计的替代率将在一定程度上被夸大。为了验证这种可能，从数据集中移除MNMs，比较不同地区之间的替代率。基因间和内含子区域根到根尖分支长度分别减少到 0.001 和 0.0008 个替换/位点； 而同义替代率保持不变。此外，远端谱系出现的共享微倒位说明同一微倒位在不同谱系中平行进化，一些多核苷酸取代事件是同源的。实际上，同源多核苷酸变化独立发生在8个基因组位点上，每个位点包含2个平行位点，共计16例，占总数目的27例。

       去掉多核苷酸替换的内含子和基因间数据集重建树。排除多核苷酸替代事件后，基因、内含子和基因间数据集的根到顶端的中间距离分别减少了4.7%、59.3%和13.6%。此外，去除多核苷酸取代增加了内含子和基因间数据拓扑结构之间的一致性。排除多核苷酸替换位点的内含子数据将 F. iturupensis + F. chiloensis 进化枝作为 F. iinumae 的姐妹，与基因间数据中的相同。

编码区和非编码区域中小删除比插入更丰富

       研究草莓属线粒体基因组结构进化，发现短插入和缺失的发生率高，在atp8、ccmFc、matR 和 rps3的编码区，确定了八个独立的缺失事件：F. chiloensis 和 F. iturupensis 共享； F. chiloensis、F. iturupensis 和 F. iinumae共享， F.chiloensis 特有； F. iturupensis 特有的两种； F. iinumae 特有的三种。相反，在F. iinumae中只发现了一个编码插入(3bp)，表明草莓属线粒体编码区中缺失比插入多。草莓属线粒体基因组在非编码区域显示出更多的插入缺失，内含子 67 个，基因间区域超过 930 个事件。 大量内含子和基因间数据的分析还表明，小片段缺失，尤其是 7-9 bp 的缺失比插入更丰富。在MIPTs 整合到被子植物线粒体基因组和拟南芥 msh1 突变体的线粒体基因组中，点突变和indel的相对频率可以用核苷酸取代与indel的比值(S/I)测量。编码区、内含子区和基因间区的S/I比分别为15.67、1.86和1.54。然而，组装的草莓谱系中S/I 比是异质的， F. chiloensis、F. iturupensis 和 F. iinumae 值比其他低得多。

基因组重排频繁，断点与大indel相关

       13个草莓属线粒体基因组进行Mauve比对，发现基因组重排引起的大规模结构变化，产生了29个不同的局部共线块(LCBs)，这些块在物种之间排列不同。重排推断系统发育树与序列分化推断的系统发育树有一定的差异。很明显，有几个物种重新排列的速度更快。F. iinumae 观察到一个长分支，代表该物种八个特有的重排事件。结构动力学成对分析证实基因组重排的变异性。F. iinumae 和 F. iturupensis 之间最大的重排距离为 15， F. mandschurica/F.pentaphylla 和 F. iturupensis。之间的距离 为14。 重要的是，由于大量重复在草莓属中是罕见的，通常是物种特异性的，通过高频重复介导的重组发生的潜在替代排列不太可能对物种间基因组重排的重建产生很大影响。三对密切相关物种的点图比较揭示了同线性断点和大 (>1 kb) 插入缺失之间的关联。映射到成对基因组比较的 16 个大插入缺失中，只有四个发生在更大的连续同线性块内：F. pentaphylla 与 F. nubicola 中的 10.1 kb 插入缺失，F. viridis 与 F. 中的 7.0kb 和 6.2 kb 插入缺失，F . mandschurica， F. chiloensis 与 F. iinumae 中的 3.3 kb 插入缺失。

突变率、多核苷酸累积、结构突变之间的关系

       两两比较表明，通常点突变率与不同类型序列积累和结构变异呈正相关。基因间区(dNC)的取代率与双核苷酸的改变有显著相关性，并与微倒位介导的多核苷酸事件发生频率存在一定的相关性。在突变率与结构变化方面，dNC与indel频率的相关性不显著，与基因组排列的相关性不显著。

结论

   文章通过测序组装13个草莓属线粒体基因组，分析其编码区30 kb和编码区200 kb非编码序列发现：

   1、DNA突变速率在线粒体基因组编码区和非编码区基本一致，但非编码区的插入缺失（indels）和倒位（inversions）发生频率更高。该结果也纠正了一些学者误认为“非编码区的序列突变速率更快”的观点。

   2、植物线粒体基因组重组频繁，即使是同一属内亲缘关系较近的物种之间，线粒体基因组的结构也存在很大差异。

   3、草莓属线粒体基因组中存在大量的由于“微倒位”（micro-inversion）引入的多碱基连锁突变（2-18 bp），而这些连续性突变位点可能会对替代速率的计算或系统发育信号的评估产生影响；同时这也拓展了进化基因组学中通常认为碱基替代都是独立发生的观点。

   4、植物线粒体基因组共线性较低很可能是由于大量DNA序列的获得或丢失造成的。

小编总结

       本研究根据植物线粒体基因组非编码部分在物种间是不同源的，提出了关于非编码区域突变率和突变谱的问题。通过组装注释草莓属13个线粒体基因组比较编码区30 kb和非编码区200 kb非编码序列，分析其序列分化率、微倒位和结构变化。同时发现同义位点和非基因位点的替代率几乎相同，说明全基因组点突变率基本一致。另外发现微倒位引起的非常多的大的多核苷酸取代，该现象可能影响系统发育和局部速率估计。草莓属线粒体基因组优先积累相对于插入的缺失和大量的基因组排列，而突变率可能与这些物种间的序列和结构变化呈正相关。

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