取一杯水窥一湖全貌——eDNA揭示水体鱼类多样性

环境DNA (eDNA)技术：环境DNA的高通量生物监测技术通过从环境介质（水、土壤、沉积物等）中提取DNA，对基因组的特定DNA片段进行PCR扩增和高通量测序，从而实现对生物群落的定性、定量分析。

相比于传统的捕捞、拖网等调查方法无创、更有效、更具成本效益且更敏感!

其中水生环境DNA是指大型生物通过粪便、体粘液、血液和脱落的皮肤组织/鳞片释放到水体环境介质中的遗传物质。水体中鱼类 eDNA 的普遍存在使该技术广泛应用于检测生物入侵、稀有或受威胁物种、生物多样性监测等方面。

eDNA技术流程

环境样本采集——富集——提取总DNA——设计引物、扩增——高通量测序——生信分析

鱼类特异性标记定义明确（M. Miya et al., 2015 ; Valentini et al., 2016 ; Zhang et al., 2015） al., 2020 ) 以及鱼类 eDNA 采样和处理的协议已经确立（Masaki Miya 等人, 2020 ; Valentini 等人, 2016）。目前，大量努力致力于解决最具挑战性的问题，该问题与定量鱼类 eDNA 数据及其在常规生物监测中推断鱼类指数的应用有关。

EST：我国近岸环境人类活动对鱼类生物多样性影响的综合评估

环境DNA (eDNA)作为一种快速、综合、可大规模应用的海洋生物监测方法，近年来引起了广泛关注。在指导沿海生态系统管理的大规模常规应用之前，应先对生态评估方法的可靠性进行评估。基于eDNA的鱼类监测已被应用于各种海洋生态系统，包括河口、内海、海岸、海洋和深海，但eDNA方法存在一些局限性，如采样效率有限、各种假阳性与假阴性错误、区域鱼类条形码数据不足导致的物种注释效果不佳以及生物信息学分析流程中准确性。

论文题目：Holistic impact evaluation of human activities on the coastal fish biodiversity in the Chinese coastal environment

发表期刊：Environmental Science & Technology

IF：9.028

发表时间：2022.5

通讯作者：张效伟、李宏俊

通讯作者单位：南京大学环境学院；国家海洋环境监测中心

DOI:10.1021/acs.est.2c01339

近海海岸的生态质量和资源受到各种人类活动的威胁，例如污染和渔业。由于缺乏高效、标准化的生物多样性监测和评估方法，极大限制了对广阔海岸带上生态系统环境压力影响的评估。综合环境DNA (eDNA)和生物生态特征（Trait），本研究建立了评估环境污染和水产养殖对我国近岸地区鱼类生物多样性影响的综合评价方法。

以黄海鸭绿江口和南海南澳岛海域为代表性研究区域，验证了eDNA生物监测工作流程的适用性。

（1）首先，22个采样点的eDNA结果达到了每个区域85%以上的物种或asv的渐近线。两个区域eDNA共检测到115种鱼类，其中南澳岛的鱼类物种丰富度是鸭绿江口的1.8倍，且检出鱼类组成与历史数据一致。

（2）eDNA揭示了两海域鱼类序列、分类多样性和功能多样性的明显差异，并呈现出随海域距离变化的趋势。

（3）鸭绿江口鱼类序列多样性主要受河口污染因子(化学需氧量和锌)的影响。与非养殖区相比，南澳岛养殖区鱼类序列多样性较低。

通过整合生态特征，eDNA方法为未来国家和全球沿海环境鱼类生物多样性监测和评估提供了机会。

材料与方法

构建中国鱼类12S-rDNA条形码参考数据库

（1）   从fishbase.org网站获得鱼类分类信息

（2）   从NCBI Taxonomy Browser获得每种鱼类的“taxid”

（3）   通过搜素““[taxid] 12S”获得每种鱼的12S-rDNA序列

（4）  对于没有公开的12S-rDNA序列但有全基因组信息的物种，选择其全基因组中相应的12S-rDNA片段；如果一个物种有2个及以上的12S序列时，比对后去重复

最终筛选出57目中国鱼类3757种，其中海鱼2015种。此外，对全球5496条12S-rDNA条形码海鱼进行了筛选。

eDNA取样、提DNA、扩增、测序

（1）  在鸭绿江口和南澳岛海域 利用便携式水环境DNA过滤仪搭配富集器采集表层海水（22个采样点(每个采样点1 L)），过膜

（2）   使用DNeasy Blood & Tissue Kit提取DNA（66个海水样品、3个空白滤膜、3个提取空白和3个阴性对照（DEPC水））

（3）   使用12S-rRNA引物Teleo扩增。

primer-F 5′:barcode-ACACCGCCCGTCACTCT;

primer-R 5′:CTTCCGGTACACTTACCATG

扩增片段长度约为63 bp

（4）   使用Ion Torrent S5测序仪进行测序

结合环境DNA和生态特征的中国沿海地区鱼类生物多样性监测和评估框架

主要结果

eDNA注释

本研究利用便携式水环境DNA过滤仪搭配富集器采集表层海水，通过DNA提取、PCR扩增、测序比对等步骤在鸭绿江口检测到鱼类物种14目24科43属46种，南澳岛区检测到10目33科70属81种，南澳岛区域鱼类物种丰富度是鸭绿江口的1.76倍。eDNA所检出鱼类有76.09%可被鸭绿江口历史渔获物种验证，但是在南澳岛海域仅有35.8%。监测结果还表明，处于海洋保护区中的鱼类丰富度显著高于非保护区。

eDNA流程和研究区域。(A)研究流程。(B)鸭绿江口(宝蓝色)和南澳岛海域(深粉色)采样点和水深。(C)随取样地点增加，在这两个区域检获的ASV鱼类数目及种类数目的累积曲线。垂直虚线表示采样中达到的最大点数

区域间和区域内不同多样性方面的变化

在研究的沿海地区，eDNA揭示了鱼类序列、分类和功能多样性的显著差异。在南澳岛区中低营养级的鱼类的检出率是鸭绿江口地区的1.64倍。且两地优势鱼类物种并不相同，例如在鸭绿江口中营养鱼类Engraulis japonicus是优势鱼类(在所有采样点都检测到较高的相对丰度)，但在南澳岛中很少有eDNA信号(图2C)，这与捕捞记录和鱼类食物网结果一致。

另外随着采样点与岸边的距离逐渐增加，鸭绿江口地区鱼类序列多样性急剧增加然后趋于稳定，而南澳岛地区鱼类序列多样性呈现持续升高趋势。鱼类分类学多样性和功能多样性在鸭绿江口随着离岸距离的增加逐渐降低，而在南澳岛地区，其呈先增加后降低之后再增加的趋势（图3）。此外，无论是在南澳岛还是鸭绿江口地区，鱼类分类学多样性和功能多样性具有显著正相关的一致性变化趋势。

鸭绿江口和南澳岛区环境DNA监测的鱼类分类多样性。根据环境DNA和历史渔获量记录( D )，在22个采样点中每个鱼种的ASV数量( A )、检出率( B )和相对丰度( C )。对于每个区域，从左到右的点表示距离岸边的距离不断增加。

鸭绿江口和南澳岛区不同多样性面和近海距离的相关分析。( A )序列多样性、分类多样性和功能多样性( 从上到下)与近岸距离之间的局部加权散点图平滑( LOESS )相关性。( B )鱼类分类多样性与功能多样性的相关性。

河口污染影响评价

在鸭绿江口地区，河口污染因素（COD和Zn，其次为盐度和硝酸盐）导致鱼类群落序列多样性明显下降。分类学多样性主要与pH和Zn有关，其中pH相关性最强(  p < 0.008 , r = 0.3178 )。与功能多样性相关的环境因子数量最少，只有石油类具有显著相关性( p < 0.023 , r = 0.3473 )。

鸭绿江口污染( A )和南澳岛区养殖( B )对鱼类序列、分类学和功能多样性的影响。( A )环境变量之间的关系通过Spearman’s相关系数和不同多样性面在鸭绿江口污染中的Mantel test分析。( B )通过Wilcoxon检验在NAO中不同育种管理区域多样性方面的差异。DO：溶解氧；TS：总悬浮颗粒物；COD：化学需氧量；NH4：氨氮。

海岛水产养殖影响评价

在南澳岛中，非养殖区的鱼类群落序列多样性显著高于养殖区，但分类多样性在这两个区域没有显著差异。与非养殖区相比，养殖区的功能多样性显著增加(  Wilcoxon检验 , p < 0.013 )。限育区各多样性方面与其他区域差异不显著(图4B )。

1.能不能测出来所有的物种？

理论上不可能测出来所有的物种，原因有两个，第一个就是目前参考数据库还并不完善，有很多物种目前还没有对应的barcode序列；第二个原因就是无论是选择哪一段目标序列，都无法做到准确区分所有物种，肯定会存在一些在测序区域序列相似度特别高甚至序列一致而无法得到有效区分的物种。

对于第二个问题，其实理论上来说也不可能完全解决，一个针对目标研究区域的个性化参考数据库可能会部分解决注释错误的问题，但是肯定也没办法做到100%的准确，就像这篇文章专门建立了一个我国鱼类12S rRNA的参考数据库，确实能够提高分类学注释的准确性，但是从结果中也可以看出，eDNA结果和历史观测数据的一致性在鸭绿江口区域为76.09%，但是在南澳岛区域也只有35.8%。

在进行大型生物eDNA的研究中，感觉最重要的一个问题就是要理解“永远也不可能做到100%的准确”，所以不要总是纠结在一些注释到的物种可能是不对的，更应该在研究的过程中尽量弱化具体物种的出现频率，而是使用一些综合性的评价指数，比如alpha多样性指数、beta多样性指数、功能多样性，或者是一些生态功能分类，比如营养级、生活习性、食性等等，来代替具体的物种来达到研究的目的。

在未来的研究中，通过eDNA元条形码技术结合多个通用引物将提高鱼类物种组合的覆盖度。