基因家族高分案例大放送|苦荞细胞色素P450基因家族

导论

细胞色素 P450 单加氧酶 (CYP) 超家族成员在类黄酮的合成、植物生长和发育中发挥着至关重要的作用。CYP 家族的全基因组分析已在几种植物中进行，但在苦荞 中CYP 家族尚未研究。苦荞是唯一含有芦丁的假荞麦，是一种药用和食品同源作物。苦荞因其芦丁含量高，被认为是研究黄酮类化合物生物合成的模式植物。

论文ID

原名：Cytochrome P450 family: Genome-wide identifification provides insights into the rutin synthesis pathway in Tartary buckwheat and the improvement of agricultural product quality

译名：细胞色素P450家族:全基因组鉴定为研究苦荞麦中芦丁的合成途径和提高农产品品质提供了依据

期刊：Biological Macromolecules

影响因子：6.953

发表时间：2020.12

通讯作者：Moyang Liu

通讯作者单位：四川农业大学

DOI：10.1016/j.ijbiomac.2020.09.008

分析内容

研究结果

1.基因家族鉴定

选择拟南芥为参考物种，使用HMMER+blastp+pfamscan软件，结构域P450 domain（PF00067）作为鉴定苦荞的依据，共鉴定到258个CYP家族成员。

2.家族成员理化性质分析和亚细胞定位

使用ExPASy网站对鉴定到的苦荞CYP家族成员进行理化性质分析，最小的蛋白质(FtCYP147)由50个氨基酸组成，为5.97kDa，最大的蛋白质(FtCYP31)由979个氨基酸组成，为111.73kDa；FtCYP84蛋白的PI(等电点)最低（4.22），FtCYP146蛋白的PI最高（9.84）。

位于细胞质FtCYP蛋白108个，位于质膜FtCYP蛋白81个，位于线粒体FtCYP蛋白63个，位于细胞外FtCYP蛋白12个，细胞核FtCYP蛋白只有9个。

3.系统发育分析

选择了拟南芥（262个家族成员）和苦荞（258个家族成员）2个物种的CYP成员进行系统发育进化树分析，使用ClustalX 1.81进行多序列比对，采用NJ法构树，使用Mega 7.0进行树可视化，构树选择模型参数：Poisson model+ 1000 bootstrap。共分为了10个家族。

                                        图1 苦荞与拟南芥285个CYP基因间亲缘关系的无根系统发育树

4.基因结构和motif分析

使用GSDS网址进行基因结构分析，使用MEME软件进行保守motif分析，将258个CYP超家族分为了10家族，39亚家族。几乎所有的FtCYP蛋白都含有CypX和P450保守结构域，每个FtCYP蛋白编码序列都由内含子分割，范围为0~15。各亚家族成员的基序组成不同，但同一亚群蛋白的基序组成相似。来自同一亚群的FtCYP蛋白基序组成的相似性表明，各亚群的蛋白结构高度保守，同一亚家族的保守结构和基序进一步验证了系统发育树的可靠性。

                                                       图2 基因结构和motif分析

5.FtCYP蛋白的染色体分布、复制事件和共线分析

使用MCScanX和Tbtools进行了染色体分布、复制事件和共线分析。有62对串联复制和18对片段复制。从以上结果可以看出，FtCYP成员可能是由串联和片段重复事件产生的，这是FtCYP基因家族进化的动力，其中串联重复是主要驱动力。

                                                              图3 基因定位和串联复制

                                                                    图4 物种内共线性分析

6.FtCYP蛋白的进化分析及其在几种不同物种中的扩增

在研究了FtCYP蛋白的结构和染色体定位等基本信息后，深入研究不同植物物种中CYP蛋白的进化关系。利用双子叶植物（苦荞+ 拟南芥+番茄+烟草+大豆+水稻+甘蔗）的CYP蛋白构建了系统发育树。CYP74家族中的所有蛋白都包含基序4和2，其中大部分包含基序4、2、5和6。除AtCYP702A1外，CYP85家族的所有蛋白均包含基序1、4和7；CYP51、CYP710和CYP86家族的所有蛋白均包含基序1、2、3、5、7和9；CYP97家族和CYP72家族的大部分蛋白质包含基序1到10。一般来说，同一家族的CYP蛋白包含相似的基序，且相同基序的位置相对一致。

                                               图5 7种不同植物中CYP蛋白的系统发育关系和基序组成

基于不同植物中CYP蛋白的进化关系和基序组成，确定了双子叶植物拟南芥、烟草、番茄、大豆、苦荞和单子叶植物水稻的共线性关系，进一步探讨CYP蛋白的进化起源。FtCYP基因在其他植物中有许多同源基因对，大豆（86对分散在所有染色体上）、番茄（57对分散在所有染色体上）、拟南芥（28对同源基因对分散在所有染色体上）、番茄（除染色体7、10、11外的所有染色体上13对），烟草L.（5对分散在染色体4和6上）。在对苦荞与其他植物物种共线性关系的研究中，发现同源基因对较多，说明这些基因可能在进化过程中发挥了重要作用。

                                                                                          图6 苦荞CYP基因与5种代表性植物的共线性分析

7.FtCYP蛋白在不同组织中的表达模式

为了进一步验证来自不同家族的FtCYP基因的功能，测定了它们在花、叶、根、茎和果实中的表达水平。结果显示，29个FtCYP基因的表达模式不同，说明它们可能在植物发育过程中发挥不同的功能。除9个FtCYP基因(FtCYP35、FtCYP39、FtCYP89、FtCYP115、FtCYP124、FtCYP125、FtCYP181、FtCYP267、FtCYP268)外，所有FtCYP基因在5个组织中均有表达。

                                                       图7 29个FtCYP基因的组织特异性基因表达及其与FtCYP基因表达模式的相关性

8.果实不同发育阶段FtCYP蛋白的表达模式

为了进一步筛选参与调控果实发育的FtCYP基因，我们检测了果实不同发育过程中FtCYP基因在不同发育过程中的表达水平。13、19和25个基因在果实中的表达模式均不同。

                                                              图8 27个FtCYP基因在果实不同发育阶段的表达情况及其与FtCYP基因表达模式的相关性

9. 苦荞中黄酮醇合成途径

发现 FtMYB13、FtMYB14、FtMYB15 和 FtMYB16 可调节苦荞芦丁的合成。激素和非生物胁迫可以影响黄酮通路基因的表达，进而影响黄酮的含量。 激素、光照、温度等外界因素也会影响苦荞黄酮合成途径基因中的基因表达水平，从而影响果实中芦丁的积累，从而形成不同颜色的苦荞果实。

                                                                   图9 苦荞中黄酮醇合成途径示意图

结论

1.本研究在基因组水平上对FtCYP基因进行了表征。通过研究285个FtCYP基因的基因结构和基序组成，它们与其他植物中CYP基因的进化关系，以及不同发育时期不同组织和果实中的表达，确定了调控芦丁合成和生长的候选基因。 2.还初步鉴定了可能调控果实大小的CYP基因。虽然这些候选基因的功能仍有待验证，但本研究可为提高苦荞芦丁含量和生产优质苦荞农产品奠定坚实的基础。

文献链接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2020.09.008