经典案例|5分+DNA指纹图谱联合遗传多样性分析案例解析

烟草(Nicotiana tabacum L.)是茄科一年生或有限多年生草本植物。作为一种重要的经济作物，在世界各地广泛种植，也是最早用于分子生物学和基因工程研究的模式植物之一。在我国，雪茄烟草种质资源相对匮乏，仅占烟草种质资源的3%，大多从国外进口。品种混杂现象突出，且遗传背景不清晰，这给雪茄种质资源的收集编目、保存鉴定、新品种选育等工作造成了很大困难。因此，明确我国现有的雪茄烟种质资源遗传结构、资源间亲缘关系，系统构建我国首套雪茄烟 SNP 指纹图谱，对雪茄烟资源收集鉴定、选育和产业发展具有重要意义。

原名：Construction of a SNP Fingerprinting Database and Population Genetic Analysis of Cigar Tobacco Germplasm Resources in China译名：中国雪茄种质资源SNP指纹图谱构建及群体遗传分析

期刊：Frontiers in Plant Science

IF：5.753

发表时间：2021年2月

通讯作者：刘国祥 张兴伟

通讯作者单位：中国农业科学院烟草研究所

DOI：10.3389/fpls.2021.618133

材料与方法

研究材料：测序材料为来自国内主要育种单位的113个雪茄烟叶品种(经鉴定和注册)。为进行核心SNP标记验证，利用来自国内主要育种单位的43份雪茄烟叶材料和216份雪茄烟叶材料进行DNA指纹图谱分析。

每份资源在苗期随机选择7株长势较好且一致的植株取其幼嫩叶片总计0.5g于2mL离心管中，干冰速冻，−80℃保存。

技术方法：提取DNA后进行简化基因组测序，采用GBS技术（EcoRI和NIaIII双酶切），测序平台：Illumina Novaseq6000。 KASP实验

技术路线

结果

*01SNP鉴定

采用 GBS 测序技术对 113 份供试雪茄烟草种质资源进行基因组简化测序。最终得到 580，942 个高质量 SNP 用于后续分析。对这些 SNP 的变异类型统计发现 6 种变异类型的SNP 中 C/T 和 A/G 变异类型最多，分别占比 27.68%和 27.59%，即 321102 个 SNP 发生了碱基转换、259840 个发生了碱基颠换。进一步对它们在基因组的分布情况统计发现 92.20%的 SNP 位于基因间区，4.10%的位于内含子区，1.50%的 SNP 位于外显子区，位于转录起始位点上游 1kb 区域内的有 1.06%，位于转录终止位点下游 1kb 区域内的有1.03%，位于基因上游 1kb 区域同时又位于另一基因下游 1kb 区域的占 0.05%，5′UTR、3′UTR 区则分别占比 0.03%、0.02%，位于剪切位点（Splicing）的最少，占 0.02%（图 2-1B）。导致编码氨基酸改变的非同义突变（nonsynonymous SNV）有 5807 个，有 2658 个没有造成氨基酸序列改变的同义突变（synonymous SNV）；另外有606 个 SNP（stopgain）导致提前获得终止密码子、26 个 SNP（stoploss）导致终止密码子丧失。

                                                                           SNP 类型与分布统计

*02

基于全基因组 SNP 的群体遗传分析

本研究首次利用 SNP 位点研究雪茄烟不同种群间的遗传分化，利用筛选过滤的 580942 个高质量 SNP，基于主成分分析、遗传结构分析和聚类分析3 种方法对供试材料进行分析，分析结果基本一致，这表明了 SNP 对雪茄烟群体间与群体内亲缘关系阐明情况的可靠性。结果表明供试材料存在 4 个亚群结构，亚群间存在一定程度的基因交流，除了来自巴西的五个种质和 B101 单独聚为一类，其余的雪茄烟种质交叉分布于另外 3 个类群内，从聚类图中可以直观的看到相同地理来源的烟草种质在类群划分中不存在相对聚合现象，即同一地理来源的雪茄烟种质资源分布于不同的 3 个类群中。但同一来源的雪茄卷烟在支系中聚集，表明这些雪茄卷烟的遗传背景复杂多样。同一地理区域的雪茄烟品种既有相互联系又相互独立。

                                                                     基于 SNP 位点的群体遗传分析

*03

KASP引物的设计及核心SNP位点的选择

对获得的 SNP 位点根据以下标准进行筛选：（1）均匀分布在 24 条烟草染色体上；（2）没有基因型数据缺失；（3）位点的未测通材料数< 20，次要等位基因频率（MAF）≥0.34；(4)多态性信息含量（PIC）> 0.35；（5）HWE 检验 p 值为≥0.01；（6）用Plink1.9 按条件--indep-pairwise 50 10 0.2 去除 LD 值比较高的两个位点中的一个；（7）多态性位点前后 100 bp 无其他突变。最终得到163个SNP位点。对于筛选获得的163个 SNP 位点，截取其前后各 100 bp 序列开发设计KASP引物，其中133个(81.6%)成功转化为KASP标记。

                      基于216份雪茄卷烟材料的715个SNP标记的PIC (A)、MAF (B)、杂合度(C)和遗传多样性(D)值

利用133个KASP标记对113份用于GBS的雪茄材料中的96份进行KASP基因分型验证 ，根据分型结果筛选出76个准确性高的KASP标记。选取43份材料作为候选标记的候选验证群体，筛选出结果较好的标记作为核心标记和候选核心标记用于后续研究。最终筛选到47对核心KASP标记，24对候选核心标记。

*04

DNA指纹图谱构建

利用47对核心SNP引物对216个供试材料的分型结果进行雪茄烟种质资源指纹图谱的构建。其中每一行代表一个 SNP 标记，每一列代表一份材料，黄色，绿色，蓝色和紫色分别代表核苷酸 C/C，A/A，T/T 和 G/G。缺少的数据以灰色显示，杂合位点以白色显示。

                                                                    216份雪茄烟草品种指纹图谱分析

利用在线软件草料二维码生成器（http://cli.im/）对 216 份雪茄烟种质资源进行编码，为每份种质构建了一份指纹图谱二维码。

                                                              216份（此处只展示部分）雪茄烟草种质的二维码

*05

雪茄种质资源鉴定

根据47对核心标记计算了 216 个雪茄烟草种质资源的遗传距离矩阵。发现部分品种间的遗传距离为 0。之后又利用 24 对候选核心引物对这些品种进行再次鉴定，并计算其遗传距离，结果表明，HN000129 和 HN000132，HN000137、HN000027 和 HN000192，HN000018 和 HN000019，沂水大弯筋和沂水大弯筋，古巴2号-1 和古巴2号-2，HN000147、HN000148、HN000149 和 HN000177，HN000187 和HN000188，HN000182 和 HN000083，HN000172、山东-1 和HN000175，Havana 1号和 HN000179，HN000100和 HN000110，Connecticut Shade 和 Bad Geudertheimer Landsorte，HN000101和HN000102， Geudetthelmex、Havana10 和Lanka 23，Havana 38 和Philippin 材料间的遗传距离依然为 0。把这些材料在田间种植并进一步对其鉴定，结合田间表型性状结果发现这些品种确为同一品种。

结论

本研究利用简化基因组测序对 113 份雪茄烟草种质资源进行遗传分析，并开发出一套完整的 SNP 核心标记，对 216 份雪茄烟资源进行指纹图谱构建。

1、明确了我国雪茄烟种质资源遗传多样性水平。来源地相同的种质分布在不同亚群，即 113 份雪茄烟种质资源没有按地理来源进行聚类，说明我国雪茄烟种质资源具有丰富的遗传多样性，复杂多样的遗传背景，可为今后雪茄烟育种研究提供宝贵的资源材料。

2、开发了首套雪茄烟 SNP 核心标记。根据MAF、哈温平衡、LD、PIC等筛选条件，最终获得163个SNP位点，成功开发133 个 KASP 标记，经验证最终筛选到 47 个核心标记和 24 个候选核心标记。

3、构建了雪茄烟种质资源 SNP 指纹图谱。利用得到的 47 个核心标记，对 216 个雪茄烟种质资源进行基因型检测。利用基因型检测结果构建雪茄烟种质资源指纹图谱，并为每份种质编码了一份指纹图谱二维码。