测序数据再利用，轻松发3分+小文章，这种思路一定要知道！

DNA是生物携带遗传信息的载体。在高等植物细胞内除了起主要遗传作用的细胞核染色体携带遗传信息之外，还有两个具有半自主遗传体系的细胞器——叶绿体和线粒体携带相关的遗传信息。从1986年首次获得烟草和地钱的叶绿体基因组及1992年首次获得地钱的线粒体基因组完整序列以来，叶绿体及线粒体基因组数据迅速增加充实。由加拿大科学家发起的“细胞器基因组测序计划”及其进一步的实施，更是促进了大批量物种的叶绿体及线粒体基因组测序的步伐。

植物的细胞器（叶绿体和线粒体）基因组序列为研究植物分子生态及进化提供了重要的资源和信息。随着高通量测序技术的发展，越来越多的植物全基因组被测序。然而，由于植物的细胞器基因组难于和核基因组分离，这使植物中单独分离纯化细胞器测序变的非常麻烦、困难及耗时长。因此，能从植物全基因组测序数据中组装叶绿体及线粒体基因组变的非常重要。截至 2021 年底，约有 973 篇文章报道了植物全基因组精细图和草图的绘制，涉及 893 个不同的物种。截止目前，植物叶绿体种及种下物种已公布7992个数据，植物线粒体基因组已公布468个左右。日前公司收集了已公布的植物基因组信息，包括未组装注释和已组装注释的叶绿体线粒体基因组。

                                            图1截止到2022年5月网站已公布植物基因组信息表（部分）

备注细胞器细胞器网站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse#!/organelles/

基因组网站：http://cbcb.cdutcm.edu.cn/TCMPG/resource/plants/

http://cbcb.cdutcm.edu.cn/TCMPG/resource/plants/

南京集思慧远生物科技公司是是一家专业从事高通量生物检测服务的企业，在植物叶绿体线粒体测序组装组注释中已积累丰富的经验，先后测序了几百种植物叶绿体线粒体基因组，同时公司还有线粒体基因组组装专利，是目前国内细胞器基因组测序的“领航”公司之一。公司目前已发表细胞器文章200余篇，分别发表在不同的杂志上，如《Genomics》、《Horticulture Research》、《InteRNAtional JouRNAl of Molecular Sciences》、《Ecology and Evolution》、《Frontiers in Genetics》、《BMC Plant Biology》、《genes》等。

下面给客户分享两篇客户先做完基因组denovo，同时组装注释线粒体基因组的文章：

2020年8月江苏农科院休闲农业研究所课题组发表了题目为“The Acer truncatum genome provides insights into the nervonic acid biosynthesis”元宝枫基因组。同时利用基因组数据组装注释元宝枫线粒体，2022年1月在《BMC Plant Biology》期刊发表题为“Assembly and comparative analysis of the first complete mitochondrial genome of Acer truncatum Bunge: a woody oil-tree species producing nervonic acid”。2019年12月浙江大学发表题为“The persimmon (Diospyros oleifera Cheng) genome provides new insights into the inheritance of astringency and ancestral evoluti”油柿基因组。同时利用基因组数据组装注释线粒体基因组，2022年6月30日在《Heliyon》发表题为“Characterization and phylogenetic analysis of the complete mitochondrial genome sequence of Diospyros oleifera, the first representative from the family Ebenaceae”×

元宝枫完整线粒体基因组的组装和比较分析

论文ID

IF：4.215（Q1）

期刊：BMC Plant Biology

时间：2022年1月13日

单位：江苏省农科院休闲农业研究所

原文链接：/doi.org/10.1186/s12870-021-03416-5

导 语

元宝枫是一种多用途、产油的木本树种，主要分布在中国北方、日本和韩国。它是药用化合物的潜在来源，包括类黄酮、生物碱、单宁和萜类化合物。此外，元宝枫籽油含有约90%的不饱和脂肪酸被列为新的食品资源。线粒体是细胞的“能量工厂”，主要功能是在活细胞中将生物质能转化为化学能。线粒体和叶绿体的DNA是母系遗传。另外核基因组和细胞器基因组之间的基因转移是植物进化过程中的普遍现象。随着测序和基因组组装技术的迅速发展，线粒体基因组信息越来越多，但比其他细胞器更复杂，更难组装。植物线粒体基因组具有物种特异性，在长度、基因顺序和基因含量上存在很大差异，基因组大小从66kb-11.3 Mb不等，大部分物种大小是200–800 kb。基因组大小的差异主要是由于重复序列重组以及其他生物体的外源DNA。重复序列包括SSR、串联重复、散在重复。SSR是植物有丝分裂基因组中鉴定物种的常用分子标记。此外，线粒体基因组内的插入/缺失（INDEL）和单核苷酸多态性（SNPs）用于区分物种及系统发育分析。

结 果

基因组特征

线粒体基因组上传NCBI 登录号为MZ318049，长791052 bp，为环状结构，ATGC占比分别是27.11%、 27.21% 、 22.79% 、 22.89% 、 GC 含量为 45.68%；PCGs和顺式内含子含量分别是 4.31%、 2.94%， tRNAs 和 rRNAs分别是0.22%、 0.67%。独有基因62个，分别是35个PCGs， 23个 tRNAs，4 个rRNAs。另外cox1基因有两个拷贝。此外有5个tRNAs 和1个rRNA位于重复序列中，有2个或4个拷贝。

RSCU分析

线粒体基因组PCGs长 34,059 bp，大部分是以起始密码子ATG开始，atp6、 nad1、nad4L以ACG 开始（可能是第二个位点C-to-U RNA编辑）；有三种终止密码子分别是 TAA、 TGA、TAG，C-U RNA在终止密码子中不存在。RSCU分析，最常用的是亮氨酸（Leu）（11.2-11.3%）、丝氨酸（Ser）（10.6-11.0%）和精氨酸酶（Arg）（8.1-8.4%），而半胱氨酸（Cys）、色氨酸（Trp）很少。RSCU 分析其编码11316密码子，发现几乎所有NNT和NNA的RSCU都高于1.0，Ile（AUA，0.82）、Leu（CUA，0.93）和Ser（UCA，0.97）除外。密码子使用偏向第三个密码子位置的A或T。

Ka/Ks分析

测定了26个PCGs的Ka/Ks比率，这些基因都存在于元宝枫、漾濞槭、拟南芥、茶中。元宝枫和漾濞槭的PCGs同源性最高，其中21个 PCGs的Ka/Ks值为0。此外几乎所有的Ka/Ks都小于1.0，表明大多数PCG在进化过程中受到纯化选择。相反，9个基因（atp6、cob、cox1、nad2、ccmFn、nad4、nad6、nad7和rpl5）的值大于1.0，表明它们在进化过程中受自然选择。atp4、ccmB、rps4的Ka/Ks接近1，表明自共同祖先分化以来经历了中性进化。RNA 编辑预测

对四种被子植物的26 PCGs进行RNA 编辑预测，元宝枫、漾濞槭、拟南芥、茶的RNA 编辑位点分别是421、427、342、288，说明这些位点在PCG中极其保守。421 RNA编辑位点都是 C-U ，在这些位点中有3207个和67.93%的发生在第一个或第二个位点上，第三位点中没有发现。atp6、nad1和nad4L用ACG作为起始密码子，推断可能已被RNA编辑所改变。不同基因中RNA编辑位点的数量差异很大，在ccmB、ccmC、ccmFn和ccmFc、复合物I（NADH脱氢酶）、nad4基因中预测的数量最大。在元宝枫和漾濞槭atp9 和 nad3未发现RNA 编辑位点。重复序列分析

元宝枫有503个长重复序列，287 个正向，179 个回文，33个反向，1个互补序列，重复序列总长度为 144,318 bp，占基因组的18.24%。 35–50 bp的重复序列最多（254），24个重复序列超过1kb，最长的为28,452 bp。五对大重复序列（>1kb）重排产生两个亚基因组环，分别是457840bp和33321bp。另外漾濞槭的线粒体基因组中的重复序列进一步表征槭树物种中的重复序列，发现500个长重复，271个正向（54.20%）、88个回文（17.60%）和141个反向（28.20%），无互补重复。漾濞槭的长重复序列总长度是138,024 bp，占总基因组的17.18%，大多数重复序列长度为41-60bp（288个），最长为27124bp

元宝枫共717 SSRs，分别是226 个mono-、 355 个di-、49个 tri-、67个 tetra-、 18 个penta-、2 个hexanucleo-tide 。81% 为mono- 和 di-，mono-中A/T占 85.40%，di-中AT/TA占45.07%。SSR中较高的AT含量进一步说明基因组高AT 含量。

系统发育分析

从NCBI 上下载了25个物种的线粒体基因组，用26个基因组的25个单拷贝同源保守基因构建系统进化树。进化树中23个节点中有21个具有超过70%的支持值，其中12个为100%支持的节点，元宝枫和漾濞槭亲缘关系最近，它俩与茶的亲缘关系较近，该结论与核基因组的推断相似。质体和核共享序列转移

用元宝枫的线粒体基因组序列检索叶绿体和核基因组的序列， 230.0 kb从核基因组转移到线粒体基因组，根据核-线粒体排布发现序列覆盖在每条染色体上，然而总长度和覆盖率不同，1号染色体占比长度最大（25.30kb），比其他染色体大得多，而5号、6号、13号染色体覆盖率最高（0.05%）。片段长度主要在200-400bp之间，核基因组和线粒体基因组共有62241bp的序列，包括trnN GTT、rpl5、trnS GCT、trnF GAA、trnQ TTG、atp1、trnHGTG完整基因及matR、ccmFN、cox2、rps3、rps4、atp8、sdh4、nad4、atp6的部分序列。元宝枫线粒体基因组是叶绿体基因组的5倍，41个片段长18,637 bp, 占基因组的2.36%，叶绿体基因组迁移到线粒体基因组，定位psbJ、trnP UGG、trnW CCA、trnN GUU、trnD GUC、trnH GUG完整基因，其他为转移基因或基因间间隔区的部分序列，并且DNA 迁移主要发生在叶绿体基因组的反向重复区。NAD1内含子indel标记的建立

为了进一步鉴定NAD1内含子比较了漾濞槭和元宝枫的序列，检查到一个33 bp indel，选择A. truncatum、 A. buergerianum, A. ginnala、 A. yangbiense、 A. palmatum、 A. pubipalmatum、 A.tonkinense.槭树物种表征NAD1内含子序列。为了开发indel标记， 设计NAD1内含子保守区域的引物，引物在七个样本中获得了预测的扩增产物，六个物种扩增的NAD1内含子序列长度相同（808 bp）且高度保守，由于假定插入了33个碱基，漾濞槭的相应序列确实更长（841个碱基）。本研究首次对槭树NAD1内含子进行鉴定，可能适用于槭树物种的分类和鉴定。

小编总结

本研究组装了元宝枫线粒体基因组，对基因特征进行描述其含有很多非编码区，高于叶绿体的含量，蛋白编码基因仅为4.31%，这可能是进化过程中序列重复逐渐增加的结果。重复序列中5对长重复序列重组形成2个亚环，cox1基因有两个拷贝。DNA片段转移分析中230kb细胞核转移到线粒体，41个片段从叶绿体转到线粒体，6个完整基因，5个tRNA和psbJ；通过INDEL分析发现NAD1内含子标记是鉴槭树属的分子标记；系统发育关系发现与漾濞槭亲缘关系最近，与茶亲缘关系较近。本研究提供了槭树属的遗传信息，并提供了对元宝枫进行进一步重要基因组育种研究的机会。

客户文章/柿科首个线粒体基因组油柿全基因组序列鉴定与系统发育分析

导 语

柿子属(Diospyros L.)是广泛分布于热带和亚热带的植物属，是被子植物中最大的属之一。柿子树在中国、韩国、日本已经被栽培为重要的水果作物几个世纪了，它含有丰富的维生素、糖、营养和抗氧化剂，以及有利于健康的各种药物和化学物质。线粒体是参与植物能量代谢的主要细胞器，进化过程中，植物线粒体基因组发生了巨大的变化，如基因顺序、基因组结构、序列从其他细胞器迁移等，比动物大100 - 10000倍，结构也更复杂。植物的mt基因组在66 kb-11.3 Mb之间存在显著的基因组大小差异。蛋白编码基因数量14 ~ 67不等;tRNA基因的数量3-27。线粒体基因组不仅在植物物种间存在差异，在同一物种内也存在差异，这与植物叶绿体基因组的保守结构形成了鲜明的对比。许多系统发育研究中mt基因组已被用作一个有价值的遗传信息来源和研究必要的细胞过程。植物线粒体基因组的这些特征(体积大、结构复杂、物种间保守性低)使植物线粒体基因组组装困难。

论文ID

原名：Characterization and phylogenetic analysis of the complete mitochondrial genome sequence of Diospyros oleifera, the first representative from the family Ebenaceae译名：柿科首个线粒体基因组油柿全基因组序列鉴定与系统发育分析

期刊：Heliyon

IF：3.776

发表时间：2022.06.30

通讯作者：龚榜初

通讯作者单位：中国林业科学研究院亚热带林业研究所

DOI：10.1016/j.heliyon.2022.e09870

实验设计

技术方法：利用油柿基因组数据组装注释油柿线粒体基因组

结 果

油柿线粒体基因组特征

油柿基因组为一个主宰环，长度 493,958 bp，注释了69个基因(39个蛋白编码基因，27个tRNAs，3个rRNAs(rn5、rn18和rn26))。38种蛋白(rps19有2个拷贝)可分为10类:ATP合酶(5个基因)、细胞色素C生物发生(4个基因)、泛素细胞色素C还原酶(1个基因)、细胞色素C氧化酶(3个基因)、成熟酶(1个基因)、转运膜蛋白(1个基因)、NADH脱氢酶(9个基因)、核糖体蛋白(LSU;四基因)、核糖体蛋白(SSU;9个基因)，琥珀酸脱氢酶(2个基因)。几乎所有蛋白编码基因均以ATG为起始密码子，4个终止密码子(TAA、TGA、TAG和CGA)的使用率分别为48.71%、30.77%、17.95%和2.57%。

油柿线粒体有27个tRNA(23个典型tRNA基因，1个trnN-GTT和3个trnM-CAT)，这些 tRNA 的平均长度为 67-88 bp，总长度 1479 bp。油柿中一些tRNA有多个拷贝；trnN-GTT两个副本，trnM-CAT四个副本。大部分tRNA二级结构中发现了G-T (U)匹配，占总mt基因组长度的8%，蛋白质编码区仅占6.5% ；54个无内含子的基因，占总数的78.26%；发现30个内含子：Nad1、nad2、nad5和nad7有4个内含子; nad4 3个内含子;cox22个内含子。CDS GC偏度为正值，线粒体基因组为负值。PCGs的GC含量(43.11%)明显低于CDS其他区域(tRNAs和rRNAs)。

重复序列分析

鉴定出87个SSR位点，四核苷酸是最丰富的类型，占已鉴定SSR的68.97%，二核苷酸、三核苷酸和五核苷酸有7个SSR，占已鉴定的8.05%。油柿线粒体基因组中只有3个单核苷酸和六核苷酸SSR序列。

AAAG/CTTT基序(16个)是最常见的循环基序，占所有已鉴定SSRs的18.39%。

油柿 mt基因组中观察到1 2个6 ~ 30 bp长串联重复序列，检测到760个30 bp以上的非串联重复序列，其中正向重复426个，回文332个，反向2个。正向最长115bp，反向最长331 bp，30 - 39 bp的重复序列在两种重复序列中最为丰富，油柿重复序列总长31 kb，占基因组的6.33%。

RNA 编辑位点预测

38个PCGs中预测了515个RNA编辑位点，其RNA编辑位点的选择具有高度的成分偏倚，所有的位点都是C-T编辑类型。油柿 mt基因组中，第2密码子位点的RNA编辑比例约为45.72%(235)，略低于第1密码子位点（259）。在515个RNA编辑位点中，只有29种密码子转移类型，对应14种氨基酸转移类型。油柿和其他物种的mt基因组中RNA编辑位点的数量和类型不同，核糖体蛋白(rps4除外)和atp酶亚基(atp6除外)有相对较少的RNA编辑衍生的取代(1 - 12位点)，而NADH脱氢酶亚基和细胞色素c生物发生基因的转录被显著编辑(11 - 36位点;)，ccmFn和ccmB预测的RNA编辑位点最多(36,35)。

油柿线粒体基因组共编码10611个氨基酸，最常用的为亮氨酸(10.25%)、丝氨酸(9.23%)和精氨酸(6.86%)，最不常用的为色氨酸(1.52%)和蛋氨酸(2.65%)。

叶绿体线粒体片段迁移分析

油柿 mt基因组包含28个叶绿体插入，长度从32-5703 bp，总长度为32.83 kb，占基因组总的6.65%。转移的序列中，叶绿体蛋白编码基因atpB、atpE、rps12、rpoB、petA、psaA和psbC从cp迁移到线粒体的过程中失去了完整性，而这些基因在油柿 mt基因组中只有部分序列。鉴定出11个完整叶绿体序列：tRNA-UGC、trnD-GUC、trnI-GAU、trnM-CAU、trnN-GUU、trnP-UGG、trnRACG、trnS-GCU、trnS-GGA、trnV-GAC和trnW-CCA。

系统发育、Ka/Ks、基因排列分析

PCGs序列进行系统发育关系分析，Apiaceae、 Aquifoliaceae、Asteraceae、 Brassicaceae、 Campanulaceae、 Convolvulaceae、 Ericaceae、Ebenaceae、 Fabaceae、 Ginkgoaceae、 Lamiaceae、 Lentibulariaceae、 Oleaceae、 Phrymaceae、 Pinaceae、Poaceae、 Rosaceae、 Rubiaceae、 Solanaceae、 Vitaceae比较集中，油柿属于柿属单系。

27个种的28个PCGs进行Ka/Ks分析，范围从V. macrocarpon的cox1基因的0.031 到D. carota的atp4基因的4.321。22个物种中，9个Ka/Ks值较高9个基因存在于油柿和葡萄基因组之间，6个基因存在于油柿和V. macrocarpon基因组之间。atp4和atp8基因的平均变异率最高，分别为1.348和0.751，这可能是正向选择和宽松选择的结果。大部分基因在进化过程中都经历了纯化选择压力，有654个蛋白的Ka/Ks值小于1，占油柿总蛋白的91.59%。

线粒体基因重排在3个 Ericales, 1个 Apiales, 1个Solanales物种中广泛存在。以油柿为参考序列发现序列或共通性很少共享，只有短片段的共通性。

结 论

本研究组装注释了油柿线粒体基因组，对其基因组特征进行描述，主要包括基因组大小、重复序列、基因结构、密码子使用、RNA编辑位点的比较分析。同时还研究了tRNA基因频繁从叶绿体转移到线粒体；系统发育分析结果表明，油柿与其他27个类群在分子上和分类学上具有一致性。这些结果将更好的了解油柿线粒体基因组特征，为进一步确定柿科植物的进化关系奠定基础。然而，由于缺乏足够有代表性的线粒体基因组，需要更多的线粒体基因组测序解析柿科的系统发育和进化生物学。

小编总结

本文线粒体二代和三代数据不是测序而来，而是用的油柿基因组测序数据。利用基因组测序原始数据组装注释油柿线粒体基因组，分析线粒体基因组特征和比较基因组学数据研究柿科的系统发育和进化生物学。测序的全基因组数据可以组装注释油柿genome/denovo,发一篇基因组文章，同时组装线粒体基因组还可以发一篇IF：3.76分的SCI文章。如果您手里也有物种全基因组测序数据，也可以参考这个这个思路，组装一个线粒体基因组，发表一篇3分左右的线粒体基因组SCI 文章。