客户文章解读 || 肠道微生物8分文章怎么写？优质好文快来看看吧

原文标题：

Normal Light-Dark and Short-Light Cycles Regulate Intestinal Inflammation, Circulating Short-chain Fatty Acids and Gut Microbiota in Period2 Gene Knockout Mice

译名：正常光暗和短光周期调节Period2基因敲除小鼠的肠道炎症、循环短链脂肪酸和肠道菌群

期刊：Frontiers in Immunology

IF：8.786（Q1）

作者单位：扬州大学动物科学与技术学院

文章链接：

https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.848248

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研究背景

哺乳动物普遍存在24小时循环的生理、代谢、行为和营养循环的规律性改变。生物钟是由环境明暗周期(LD)的适应形成的。作为生物钟的核心基因，周期生物钟2 (Per2)基因分布在大脑和脊髓等中枢神经系统，或周围器官，如皮肤和胃肠道。中枢性Per2蛋白调节边缘系统中Per2的节律性表达，这是交叉上核(SCN)协调外周生物钟运作的关键因素。Per2突变会缩短昼夜节律甚至导致昼夜节律振荡消失。已有研究表明，小鼠体内Per2的缺失会引起糖皮质激素失衡。在Per2缺乏的小鼠中，神经内分泌肽aMSH的昼夜节律被打乱，导致昼夜饮食紊乱，如夜间综合征，进而逐渐导致肥胖。

8L：16D的LD循环是最常用的环境LD循环模型，也有研究将其作为短光(SL)周期来模拟跨赤道时差。SL可诱发昼夜节律紊乱。例如，在小鼠中，当节律期提前6小时时，大脑和肌肉ARNT-like 1 (Bmal1)基因的节律就会丢失；在轮班工人中，代谢稳态失衡(肥胖、糖尿病和心血管)、免疫力下降、肿瘤和长期时差抑郁症发病率增加等疾病的增加也可能是由SL周期造成的。

研究发现肠道菌群的数量和定殖也有昼夜节律，节律紊乱可导致肠道菌群失衡，其特征是细菌的组成和功能发生改变，影响昼夜节律振荡的消失和健康。一些研究也表明，肠道微生物组可以通过多种代谢物调控Per2的表达。从肠道微生物中提取的SCFAs和乳酸可以调节Per2的相位，在使用来自肠道菌群的丁酸盐处理后，肝脏类器官中Per2表达的昼夜模式发生改变。因此，作者假设Per2可以响应不同的环境LD周期(NLD和SL)，从而调节昼夜节律振荡，影响肠道微生物群和营养代谢。

小编有话说：以上就是该项目的研究背景啦，下面跟随小编的脚步一起来看下面的内容吧。

研究意义

规律的环境明暗周期调节周期生物钟2 (Per2)基因表达对昼夜节律振荡、营养物质代谢和肠道菌群平衡至关重要。本文作者研究将环境LD循环与Per2基因敲除相结合，探究LD循环如何介导Per2的表达，从而调节循环中的结肠和盲肠炎症和屏障功能、微生物群和短链脂肪酸(SCFAs)。对Per2在不同LD周期下对结肠和盲肠炎症功能、屏障功能、肠道微生物群和SCFAs循环的调节作用进行阐释。

测定项目

血清和大肠中SCFAs浓度、结肠和盲肠上皮昼夜节律、SCFAs转运蛋白、炎症和障碍相关基因定量分析以及16S rRNA Illumina测序

技术路线

研究结果

1小鼠进食规律的变化

小鼠每日进食节律数据显示，在NLD和SL条件下，与CON小鼠相比，Per2敲除小鼠在0:00 - 2:00的摄食频率显著降低，而在12:00-14:00的摄食频率显著增加(图1)。KO对6:00-8:00和18:00-20:00的摄食频率无影响。与KO和CON小鼠的NLD相比，短光处理也没有改变每日喂养节奏。CON小鼠的摄食节律呈现夜间高、白天低的趋势，而KO小鼠则相反。

图1：KO和CON小鼠在NLD和SL下的每日进食节律

2血清中SCFAs的浓度

数据表明，Per2敲除对总SCFAs、乙酸、丙酸、丁酸和乙酸/丙酸的浓度没有显著影响。比较CON小鼠(表1)。与CON小鼠相比，短光处理也不会影响所有SCFAs指标。对血清SCFAs指标无交互作用。

表1 |血清中SCFAs浓度3结肠和盲肠内容物中SCFAs的浓度

与CON小鼠相比，Per2敲除显著降低结肠内容物中总SCFAs 、乙酸、丙酸的浓度，增加丁酸的浓度，但对异丁酸、异戊酸、戊酸和乙酸/丙酸没有影响(表2)。短光处理对SCFAs的浓度没有影响，除了与NLD相比降低了异丁酸和异戊酸。两处理间的相互作用不影响SCFAs的浓度。在盲肠内容物中SCFAs的浓度方面，KO降低了总SCFAs和乙酸，但增加了丁酸、丙酸、异丁酸、异戊酸、戊酸和乙酸/丙酸含量无差异。与NLD相比，短光对盲肠内容物的SCFAs指标没有影响。两处理间的相互作用对丙酸浓度有显著影响。

表2 |结肠和盲肠内容物中SCFAs的浓度

4结肠和盲肠上皮昼夜节律基因和Per2蛋白的相对表达

与CON小鼠相比，在NLD和SL下Per2敲除小鼠的结肠上皮(图2）和盲肠上皮(图2B）中，Per2的mRNA和蛋白表达均显著降低。Per2基因在结肠和盲肠组织中有较高的敲除效率。在其他昼夜节律基因的表达上，KO上调了Per1和Rev-erbα基因的表达。与CON小鼠相比，KO还增加了NLD下结肠上皮细胞周期昼夜节律时钟3（Per3）基因的表达（图2C）。对于盲肠上皮，KO上调了NLD和SL下Per1、隐色素2（Cry2）和Rev-erbα的表达，但下调了Clock和Bmal1基因的表达。与CON小鼠相比，KO还下调SL下Cry1基因的表达（图2D）。与NLD相比，短光治疗对结肠和盲肠上皮昼夜节律基因的表达没有影响。

图2 |在NLD和SL下KO和CON小鼠结肠和盲肠上皮昼夜节律基因和Per2蛋白的相对表达

5结肠和盲肠上皮SCFAs转运蛋白基因的相对表达

与CON小鼠相比，Per2敲除显著上调了结肠上皮NLD和SL下Na+/H+交换载体1 (Nhe1)、Na+/H+交换载体3 (Nhe3)、单羧酸转运载体1 (Mct1)和单羧酸转运载体4 (Mct4)的表达，但对Na+/H+交换载体2 (Nhe2)、阴离子交换载体2 (Ae2)和Na+/K+ ATP酶的表达无影响(图3A)。与NLD相比，短光处理进一步下调了KO小鼠结肠上皮Nhe3基因的表达(图3A)。对于盲肠上皮，KO上调了Nhe1、Nhe3和Mct4基因的表达，Nhe2, Mct1, Ae2, 和 Na+/K+ATP酶在盲肠上皮NLD和SL下均可见(图3B)。与NLD相比，短光没有改变盲肠上皮中SCFAs转运基因的表达(图3B)。

图3 |在NLD和SL下KO和CON小鼠结肠和盲肠上皮SCFAs转运蛋白基因的相对表达

6结肠和盲肠上皮炎性和屏障基因的相对表达

与CON小鼠相比，Per2敲除显著上调了结肠上皮NLD和SL下肿瘤坏死因子α(Tnf-α)基因的表达，而下调了紧密连接蛋白1 (Zo-1)、Claudin-1和Occludin基因的表达，但不影响白细胞介素1β (Il-β)和白细胞介素6 (Il-6)基因的表达(图4A)。在盲肠上皮炎性和屏障基因方面，KO显著上调 Il-β 和Tnf-α 的表达，而下调Claudin-1和Occludin的表达。然而，在NLD和SL条件下，它并不影响Il-6和Zo-1基因的表达(图4B)。与NLD相比，短光没有改变结肠和盲肠上皮炎症和屏障基因的表达。

图4 |在NLD和SL下KO和CON小鼠结肠和盲肠上皮炎症和屏障基因的相对表达

7结肠和盲肠上皮炎性通路相关基因的相对表达

与CON小鼠相比，Per2敲除显著上调toll样受体2 (Tlr2)和核因子kb (Nf-kb) p65基因的表达，但对结肠上皮NLD和SL中toll样受体4 (Tlr4) a和Myd88基因的表达均无影响(p > 0.05)(图5A)。在盲肠上皮通路相关基因方面，KO显著上调了Tlr2、Tlr4和Nf-kb p65基因的表达，但不影响Myd88在NLD和SL下的表达(图5B)。与NLD相比，短光没有改变结肠和盲肠上皮炎症通路相关基因的表达，但上调了KO小鼠盲肠上皮Tlr2基因的表达。

图5 |在NLD和SL下KO和CON小鼠结肠和盲肠上皮炎症通路相关基因的相对表达

8肠道内容物的细菌测序和多样性

表3和图6显示了NLD和SL下KO和CON小鼠肠道菌群多样性的变化，各组16S rRNA测序覆盖率均超过99%(表3)。维恩图显示，NLD+KO、NLD+ CON、SL+KO和SL+CON结肠内容物的独特细菌OTUs数量分别为29、11、20和26个，共享OTUs数量为237个(图6B1)。此外，上述各组盲肠内容物的唯一细菌OTUs分别为24、17、26和24，共有OTUs数为276(图6B2)。同时，从图6A可以看出，不同处理在细菌门和纲(部分目)分类水平上具有不同的相对丰度。丰度较高的细菌主要包括拟杆菌门的拟杆菌门、梭状芽胞杆菌门和厚壁菌门的赤毒杆菌门等。基于Unweight Unifrac距离的PCoA图计算的β-多样性(图6C)显示，KO小鼠与CON小鼠的细菌在第一个轴上完全分离，NLD和SL没有明显分离，说明Per2敲除显著改变了肠道细菌β-多样性，而短光处理没有影响。而短光治疗没有影响。最后，α-多样性(表3)显示，在结肠和盲肠微生物组NLD和SL条件下，KO小鼠的Chao 1、ACE、Shannon和Simpson指数均显著高于CON小鼠，但KO对盲肠内容物的Simpson指数无影响。短光不会影响细菌的多样性。

表3 |肠道微生物组测序覆盖率和α-多样性指标

图6 |在NLD和SL下KO和CON小鼠的细菌多样性和组成

9肠道内容物中微生物属水平的分类学差异

利用LEfSe分析了四种处理间细菌属分类的显著分类学差异(图7A)。LEfSe结果使用分类柱状图可视化，只有LDA评分超过3.5才被标记出来。在细菌属水平上，NLD+KO富集的细菌有Lachnospiraceae NK4A136、Eubacterium_xylanophilum、Roseburia、Lachnospiraceae UCG_006、Ruminiclostridium、Anaerotruncus、Rikenella、Candidatus Saccharimonas和Ruminococcaceae UCG_003属；NLD+CON富集了Erysipelatoclostridium、Prevotellaceae UCG_001、Olsenella和Christensenellaceae R_7属；SL+KO富集了Escherichia Shigella、Lactobacillus、 Eubacterium coprostanoligenes, Turicibacter, Prevotellaceae NK3B31和Marvinbryantia属 ;SL+CON富集了Parasutterella, Allobaculum, Bacteroidales S24-7 unidentified 和 Enterorhabdus属。聚类结果(图7B)显示，各类群细菌属中显著分类学差异的相对丰度高于其他类群。在NLD+KO条件下，大多数差异细菌属属于拉氏菌科（Lachnospiraceae）和瘤胃球菌科（Ruminococcaceae），而另一个差异细菌属则属于丹参科（Erysipelotrichaceae）、普氏菌科（Prevoteellaceae）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）等(图7C)，差异菌属大部分属于拟杆菌门和厚壁菌门(图7D)。

图7在NLD和SL条件下KO和CON小鼠肠道差异微生物属分类的| LEfSe分析和聚类热图

10利用PICRUSt2预测细菌功能

通过PICRUSt2的KEGG通路的细菌功能预测如图8和补充图S2所示。对KEGG主要通路的预测表明，所识别的细菌基因可能与代谢、遗传信息处理和环境信息处理相关(补充图S2)。根据代谢途径，大部分预测基因参与氨基酸和碳水化合物代谢途径(图8A)。进一步细化氨基酸代谢途径，作者发现肠道菌群功能主要与“丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢”或“精氨酸、脯氨酸代谢”等途径有关(图8B)。肠道菌群的碳水化合物代谢途径功能主要与“氨基糖和核苷酸糖代谢”、“丙酮酸代谢”等有关(图8C)。此外，SCFAs的“丙酸代谢”和“丁酸代谢”等代谢途径也得到丰富(图8C)。

图8 |通过PICRUSt2在NLD和SL下KO和CON小鼠中预测KEGG通路的细菌功能

结论

作者的数据与Per2调节肠道昼夜节律振荡的假设一致，以响应正常的明暗周期。数据显示，敲除Per2可使小鼠结肠和盲肠组织中TTFLs轴发生紊乱，改变昼夜节律基因的表达，如上调Per1和Rev-erbα、下调Bmal1和Clock等。昼夜节律紊乱进一步导致喂养节奏的丧失，进而导致肠道微生物群的改变。KO增加了肠道菌群α-多样性，显著上调了Lachnospiraceae和Ruminococcaceae的丰度，进而改变了SCFAs的代谢和转运。结果表明，KO增加了丁酸的浓度，但降低了总SCFAs和乙酸的浓度;由于Nhe1、Nhe3、Mct1和Mct4基因的上调，转运增强。这可能会导致大肠发炎。然而，短光处理对肠道微生物群和代谢的影响很小。

小编总结

本研究揭示了昼夜节律相关Per2基因对不同的环境LD周期的响应，并对其背后的潜在机制进行了探究。通过对Period2基因敲除小鼠与正常小鼠的比较，对血清、结肠及盲肠16s rRNA测序和靶向短链脂肪酸代谢组学等一系列相关基因的定量研究，探索验证了Per2在不同LD周期下如何调节昼夜节律振荡、肠道微生物群落及营养代谢。整篇内容设计思路清晰，研究结果对实际应用有巨大意义，不愧是八分好文。本研究中所应用的代谢组学、微多测序及分子实验均可在集思慧远一站式完成，如果您也想冲击微生物高分SCI 文章，那欢迎来电咨询：025-85381280。