客户文章丨两种药用獐牙菜的叶绿体基因组:龙胆科獐牙菜属的比较进化分析

引言

细胞器基因组研究时间短，见刊快，对于短期时间内期望得到一篇文章的老师，是很好的选择。就目前的叶绿体基因组研究而言，测3-5个叶绿体基因组、组装、测序、注释、分析，足够发3-5分的SCI。但如果在您研究的物种中，同科属内未测过叶绿体基因组的很少，怎样发高分文章呢，在此我们一起来看一篇我们的客户文章，本研究虽然只测序并组装了一个物种的叶绿体基因组，但经过扎实丰富的分析，同样收获了很好的成果。

希望您能从本文的文章框架和技术路线上汲取经验，以完善、丰满您的文章！

原文标题：

Complete chloroplast genomes of two medicinal Swertia species: the comparative evolutionary analysis of Swertia genus in the Gentianaceae family

译名：两种药用獐牙菜的叶绿体基因组：龙胆科獐牙菜属的比较进化分析

期刊：Planta

IF: 4.540(Q1)

作者单位：Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences

文章链接：https://doi.org/10.1007/s00425-022-03987-z

小编：首先，我们先来看这一篇文章的研究对象---龙胆科獐牙菜。

龙胆科属双子叶植物科，是濒危保护物种。龙胆科獐牙菜属全世界有170种，中国有80种。獐牙菜属广泛分布于我国西部、东部和南部，生长于海拔250-3000米的河滩、山坡草地、森林下、灌木和沼泽中。獐牙菜具有很高的药用价值，如：清热健胃利湿，可用于治疗消化不良、胃炎、黄疸、火眼、牙痛、口疮。

以下两张识别图片：獐牙菜 S. bimaculata (2100 m, 26.23°N, 108.12°E)和贵州獐牙菜S. kouitchensis (1440 m, 31.25°N, 110.21°E)分别由神农架林业区和雷公山自然保护区提供。从中国湖北省恩施市华中药用植物园收集贵州獐牙菜的鲜叶并立即用硅胶干燥用于DNA提取。

小编：插播一条，叶绿体基因组测序实验，取样一般挑选光合作用较强时期的新鲜叶片，一片叶子即可，这种硅胶干燥处理过的叶片也是可以的。

獐牙菜和贵州獐牙菜在形态上的显著区别在于茎 (1)、花梗 (2) 、叶 (3) 的形状；花冠 (4) 和种子的颜色、斑点 (5) 以及种子表面的形状。

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NO.1  

贵州獐牙菜叶绿体基因组组装注释及组成分析

DNA测序、组装得到环状的叶绿体基因组，总大小为 153,484 bp，具有保守的四分体结构。共编码 131 个基因（110 个unique基因），其中包括 88 个 PCG（80 个unique基因）、37 个 tRNA（29 个unique基因）和 8 个编码核糖体 RNA 的基因（4 个unique基因）。此外，作者还分析了基因中包含内含子情况，顺式、反式剪接情况，叶绿体基因组CDS、rRNA、tRNA及NCRs长度占比情况。

比较数据库中原有的4个獐牙菜的叶绿体基因组数据，最终选择 GenBank 编号为 MW344296 的叶绿体基因组，并将其与贵州獐牙菜的基因组进行比较。

NO.2  

密码子使用情况分析

密码子偏好可以影响基因表达水平、共翻译蛋白折叠和 mRNA 稳定性，这可以为探索物种的进化模式及其在系统发育史上的地位提供证据。在贵州獐牙菜的叶绿体基因组中，RSCU 值从 0.3816（精氨酸中的 CGC 密码子）到 1.83（亮氨酸中的 UUA 密码子）不等。在两个物种的 64 个密码子中，共观察到 31 个 RSCU 值大于 1 的密码子。尤其是UUA、AGA、GCU这三个密码子的使用率很高，显示出密码子偏向性，而Met（ATG）和Trp（TGG）仅由一个密码子编码，没有密码子偏向性。使用情况（RSCU = 1）。确切地说，16 和 13 个密码子分别以 U 和 A 结尾，占 95.55%，这表明这两个物种的密码子偏好与 20 种獐牙菜的报道结果一致（Cao et al 2022）。

NO.3

SSR多态性分析

对贵州獐牙菜和獐牙菜的的叶绿体基因组中微卫星的类型和数量进行了统计和比较，并分不同区域统计数量。同时作者分析了獐牙菜属中23个种的叶绿体基因组中的SSR多态性。

NO.4  

重复序列分析

对23个物种的重复序列进行分析，分别按类型：正向、反向、回文、互补；按长度，进行统计分析。

NO.5

比较基因组分析

对比獐牙菜属的这23 个完整叶绿体基因组发现：四种类型的 rRNA 基因在 23 个物种中最为保守和存在，而 5 种基因（accD、infA、ycf1、ycf2 和 ycf15）在编码区显示出高多样性。在 NCR、IGS 和内含子区域内发现了高度不同的区域，特别发现5个差异热点区域明显区分了 23 种獐牙菜物种，高度变异的多样化区域可用于开发DNA条形码的新引物，克隆序列的特定区域以鉴定23个獐牙菜物种。

小编：DNA条形码（DNA barcode）是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。

NO.6  

23种獐牙菜的IR边界结构和遗传特征

龙胆科獐牙菜属的IR边界结构较为保守。7种不同类型的基因(rpl22、rps19(×2)、rpl2(×2)、ycf1(×2)、ndhF、trnH和PSBA)普遍存在于大多数物种中，存在于或跨越边界地区。

NO.7

高变区识别

叶绿体基因组（cpDNA）中高度保守的区域和可变长度序列可以作为鉴定植物物种的有效方法。为了检测23种獐牙菜属植物叶绿体基因组中的高度可变区，提取了85个基因间和内含子区（NCR），并分析了它们之间的遗传距离，使用K2p模型计算基因间区域。其中，五个IGS区域（ndhF–rpl32、trnL UAG–ccsA、ycf15–trnLCAA、trnLCAA–ycf15和ndhG–ndhI）具有高K2p值（图7）。

NO.8  

属特异性DNA条形码引物

通过序列比对和ecoPrimers软件分析23种獐牙菜属植物的叶绿体基因组后，在这些叶绿体基因中29529bp和68766bp的位置之间仅鉴定出一个属特异性DNA条形码引物序列。

NO.9  

选择压力分析

使用在HyPhy软件中实现的aBSREL模型，我们观察到在特定物种中的四个基因，即ccsA和ndhK、rpoC1和rps12被正向选择。这些基因可能与獐牙菜属在极端条件下的环境适应有关，例如高温、高湿度和高压（表6）。

NO.10  

系统发育分析

使用PhyloSuite软件，通过对40个叶绿体基因组（23个獐牙菜、15个龙胆科其他属物种和2个外群物种）的多序列比对，提取了85个共有蛋白序列。基于85个共有的CDS，构建了最大似然（ML）系统发育树。可以看出獐牙菜属是一个复杂的多系群。

结论为了确定龙胆科獐牙菜属种间的进化关系，对贵州獐牙菜叶绿体全基因组进行了测序和组装注释，并结合獐牙菜的叶绿体基因组进行分析。两个物种的叶绿体基因组共编码133、134个基因，其中蛋白质编码基因88-89个，转运RNA（tRNA）基因37个，核糖体RNA基因8个。8个蛋白质编码基因和8个 tRNA 编码基因中含有一个内含子，而在2个基因（ycf3 和 clpP）中发现了两个内含子。这两个物种中密码子最丰富的氨基酸是异亮氨酸，而最不丰富的是半胱氨酸。分别鉴定出SSR的数量为 28 个和 32 个。在 23 个獐牙菜属叶绿体基因组中共鉴定出 1127 个重复序列，它们分为四类。此外，通过基因组比较，五个分歧热点区域可以区分这 23 个獐牙菜属物种。已准确鉴定出一对属特异性 DNA 条形码引物，通过特异性引物克隆分歧的区域可成为鉴定獐牙菜属不同种的有效且有力的分子标记。此外，四个基因（ccsA、ndhK、rpoC1 和 rps12）受到正向选择压力。系统发育树显示，23个獐牙菜物种聚集成一个大进化枝，包括4个明显的亚枝，而獐牙菜和贵州獐牙菜两个物种分别聚集到不同但相关的物种群。

小编

总结

一个新的叶绿体基因组，测序、组装、注释、密码子分析、SSR、散在重复序列分析是基础的标准分析，进一步高级分析包括KaKs分析（相似于本文的选择压力分析）、Pi核酸多样性分析、IRscope分析、结构比较分析、系统进化树、同源及共线性分析。

本文的亮点在于作者在高级分析的基础上通过高变区识别，进阶到DNA条形码设计，准确鉴定出一对属特异性 DNA 条形码引物，通过特异性引物克隆分歧的区域可成为鉴定獐牙菜属不同种的有效且有力的分子标记，在比较基因组学研究中融入细致全面的解读，对整个属中物种间的差异、分类提出新的思想和观点。

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