如何提高真菌基因组的组装效果

真菌是一种真核生物，其基因组大小一般不超过100 M，相对于动植物基因组要小的多。使用二代数据组装可以得到真菌基因组的很多contig，N50较小，该组装水平可以称为“基因组草图”。

随着三代测序价格的降低，二代加三代测序已经成为真菌基因组的主流。这种策略可以得到真菌基因组的“精细图”，比起只用二代数据组装，N50要大很多。此时组装结果中可能存在某些完整的染色体级别的序列，不过也有一些contig/scaffold不是染色体级别。而单单使用scaffold连接的工具，很难将contig连接成染色体级别的序列。因此，正常还需要HIC数据来辅助染色体级别的组装（准完成图）。

由于精细图的N50已经较大，足够后续的注释以及其他分析，又因测HIC数据成本不低，所以大部分人将真菌基因组做到“精细图”就已经满足了，不会再做HIC。“精细图”的组装比较容易，一般用三代软件进行组装，再用二代数据进行纠错就完成了。但是不同组装软件的不同参数，组装得到的contig数量和长度可能都会有差异。

那么这些组装结果到底哪个更好呢？由于软件组装的时候可能存在错误的连接，所以N50越大并不代表越好。我们需要挑选一个和原始数据最符合的组装结果。因此可以将原始数据比对到组装结果上，看看是否有错误的拼接，如果拼接错误，可以手动进行校正。除此之外，软件得到的每条contig未必达到最长，有些染色体因为重复序列的问题可能被分成多个contig，所以也可以将原始数据比对到组装的contig上选择长的overlap进行延伸。

三代测序无碱基偏好性，可以测到基因组上复杂的区域，而且三代读长较长，可以跨越较长的重复区（组装软件未必能做到），所以通过手动校正，不仅可以纠正软件组装错误的地方，还可以得到更长的contig，甚至是染色体水平的contig（完成图）！（一般基因组无特别特别长的重复序列、无非常高的杂合区域即可达到染色体水平）

对于有参考基因组的真菌，可以通过参考基因组来判断最终的组装结果有没有到染色体级别，对于无参的基因组可以根据端粒序列来判断：如果一条序列两端的序列是短串联重复序列，且有多条测序的序列都能支持该序列到此就“终止”了，那么可以判断该contig应该是染色体水平。

对于三代测序而言，Nanopore的碱基正确率不如Pacbio，但是它测序读长更长，因此更利于手动校正。手动校正后的结果比只用软件组装的结果可能要好很多。

下面是两个具体例子，其中一个无参，另一个有参，最终结果都到了染色体水平。

表一 4条染色体真菌基因组的组装比较（有近缘参考，nanopore数据）

* Gp_method为手动校正后的结果，未统计线粒体基因组。

表二 12条染色体真菌基因组的组装比较（无近缘参考，nanopore数据）

* 通过端粒序列可以判断每条contig均组装到染色体级别。

手动校正费时费力，所以很少有人采用该方法，但它无需HIC数据，可以节省一部分成本。此外，由于手动校正直接使用三代数据，所以最终的结果中也不会有gap，而经HIC数据连接的染色体，不进一步处理的话，是有gap存在的。

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