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文献解读

集思慧远客户发表《水稻对基腐病响应的长链非编码RNA的全基因组鉴定和鉴定》

发布日期:2019-03-17 浏览次数:312

  1.植物长非编码RNA(IncRNA)是一种新兴的表观遗传调控因子,在植物生长发育和生物胁迫反应中发挥着重要作用。然而,lncrna是否参与了水稻与Dickeya zeae之间的抗性反应尚不清楚,Dickeya zeae是一种引起水稻基腐病的细菌性病害。在本研究中,rna-seq被用来揭示由D.zeae反应性LncRNAs及其候选靶基因介导的共表达调控网络。在鉴定的4709个LncRNAs中,对D.zeae感染分别有2518个上调和2191个下调LncRNAs。采用qPCR方法研究了17个lncRNA及其在防御反应中潜在作用的预测靶点的表达变化。在D.zeae感染时,5个INcRNAs的表达水平上调,而同源候选靶基因的表达水平下降。此外,此外,一些lncrna被预测为osas - mir396和osas - mir156的靶基因模拟物。这些结果表明,IncRNAs可能通过调节水稻靶基因和miRNAs的转录水平,对D.zeae感染起反应作用。

  

  2.病原体接种

  材料:4个品种:Nanjing 40,Nanjing 45,Kasalath,Nipponbare

  采用茎基接种法和根接种法测定水稻植株对水稻基腐病病菌D.zeae的抗性。通过测定接种后10天内患病面积的百分比,将耐药率分为5组。茎、根部无明显疾病症状,表明免疫。疾病指数小于或等于5,表明抗病性很强。疾病指数从5.1到12.4表示中度抗药性。从12.5到19.9的疾病指数表示中度易感性。表示高度易感性的疾病指数等于或大于20。

  测序平台:Illumina Hiseq 2500,PE=100 bp

  分析软件:TopHat2;Cufflinks;Cuffcompare;与miRBase排除miRNA前体;CPC;Hmmer;Pfam;t test;DEGseq;HemI,Cytoscape软件

  实验验证:qRT-PCR

  

  3.结果分析

  1.耐药粳稻对D.zeae的应答

  在抗性水稻品种南京40中观察到超敏反应抑制了D. zeae的感染和侵袭,而3个易感水稻品种南京45、Kasalath和Nipponbare在10 dpi位点附近出现典型的病徵(图2A)。从根系接种实验来看,南京40号比南京45号更耐D. zeae,表现为枯叶、黑腐病症状和恶臭(图2B)。

  Fig 2 抗性和易感表型对基腐病菌感染的反应。(A)和(B)分别以基茎接种法和根接种法观察到的表型

  两次接种试验结果表明,南京40对D.zeae具有较高的抗性,因此选择南京40为材料进行高通量测序,分析了LncRNA介导的抗性机制。


  2. 水稻与基腐病不亲和相互作用中RNA-seq的研究进展

  分析RNA-seq数据,共鉴定出南京40中4841个LncRNA,其中,在感染样本(K2)和对照(K1)中分别鉴定到3221个和2713个LncRNA(图3A)。检测到的LncRNAs长度在200~1500 bp之间,200~300 bp的LncRNAs占60.8%(图3B)。这些LncRNA平均分布在12条水稻染色体上(图3C)。根据它们在基因组中的位置,分别有1581个、2138个和1122个被认为是内含子LncRNA、LincRNAs(称为长基因间非编码RNA或基因间lncRNAs)和反义lncRNAs。在图3中,它们在12条染色体上的分布是由从外到内的不同同心圆环所显示的(图3D)。

  Fig.3 LncRNA鉴定结果。(A)检测到的INcRNAs和mRNAs的数量。(B)LncRNA的长度分布。(C)两个文库中INcRNA的基因组分布。外同心圆环代表来自K1的IncRNAs,内同心圆环代表来自K2的lncRNAs。(D)三种LncRNAs的分布。内含子INcRNAs(外橙色圆)的数量,在每个染色体的500 kb(千碱基)的bin中,lincRNAs(内绿圈)和反义lncRNAs(内蓝圈)。内含子INcRNA是由蛋白质编码基因的内含子区域产生的。lincRNAs(长基因间非编码RNA)是从水稻基因组的基因间区域转录而来的。反义incRNAs是从反义链转录而来,部分重叠于一个或多个蛋白编码基因的外显子。


  3. 鉴定D.zeae应答型LncRNAs

  与K2相比,K1样品根中共鉴定出4709个LncRNAs (p值< 0.05),包括2518个上调lncRNAs和2191个下调lncRNAs(图4A)。其中,2123个LncRNA是仅在接种D.zeae后的南京40中检测到,1597个LncRNA是在对照(K1)中检测到,989个LncRNA在2组样品中均检测出(图4B)。图4C中的热图显示在K1和K2有33个lncRNA差异表达(图4C)。差异表达的lncRNA表明这些lncRNA在感染D.zeae的一定时间点后开始起作用。


  Fig.4鉴定lncRNAs对抗性水稻品种中的D. zeae有响应。(A)接种D.zeae后,抗性水稻品种中差异表达INcRNAs的数量。(B) lncrna对耐药水稻D. zeae特异性应答。K2和K1是只有在有接种和不接种的抗性水稻品种中才能检测到的INcRNAs数量。K1+K2,两个文库中检测到的INcRNA数目。(C)采用层次聚类的方法在两个文库中差异表达INcRNA。


  4. 防御途径中LncRNAs与靶基因的共表达分析

  为了识别lncRNA潜在的mRNA靶点,分析了差异表达lncRNA在100kb两侧区域内的差异表达情况。RNA-seq的转录组数据确定了与防御反应相关的多个信号通路中最重要的10个上调靶点,如植物过氧化物酶、Rab GTPase家族2 (Rab2)、替代氧化酶、MATE家族蛋白、MYB家族转录因子、K+钾转运体、黄酮类还原酶、谷胱甘肽s -转移酶等(表1)。前10个下调靶点包括过氧化物酶47、过氧化物酶A2、两个E3泛素-蛋白连接酶、两个DUFs(表1)。大多数靶点,包括过氧化物酶和E3泛素-蛋白连接酶都参与了防御反应信号通路。LncRNA及其mRNA共表达分析发现,除了OS08G0113000、OS05G0110000和OS02G0101700外,有17个LncRNA调控了20个靶点中的17个靶点表达(表1)。


  表1 在RNA-seq的基础上,对D. zeae反应前10个上调和下调靶点


  此外,通过Cytoscape软件构建了17个lncRNA-靶点的交互网络。其中有7个具有多于4个节点的网络,剩下的10个具有少于3个节点的网络(图5)。图5A所示的交互网络包含8个靶基因,包括MYB转录因子、锌指和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,这些基因在抗性水稻品种中被3个lncRNA (TCONS_00055600、TCONS_00055598和TCONS_00055597)调控,以响应D. zeae的感染。图5B所示的交互网络代表三个lncRNA(TCONS_00012775、TCONS_00012782和TCONS_00012789)调控6个靶点,包括小亚基过程体的基因编码成分、未知功能域(DUFs)蛋白和WRKY转录因子。TCONS_00080557和TCONS_00080558的靶点为含钙结合基序蛋白、磷酸-3-硫叶酸合成酶、50年代核糖体蛋白L24和过氧化物酶(图5C)。此外,在6个INcRNAs和4个目标之间发现了一个更为复杂的交互网络(图5D)。这4个靶点由无特征蛋白(OS02G0317800)、替代氧化酶(OS02G0318100)、具有7个富含亮氨酸重复序列(LRR;OS02G0317500)的f -box样蛋白(clathrin adaptor)和OS02G0317400组成,这些蛋白可能对水稻中的D. zeae有应答作用。


  Fig.5 四对lncRNAs -靶点的预测交互网络。(A)-(D)显示不同INcRNA-靶点的相互作用网络。三角形节点和矩形节点分别表示lncRNA和相关靶点。红色和绿色分别代表上调和下调的节点。线条显示了INcRNAs-靶点对之间的相互作用。实线和虚线分别表示已验证的和未验证的IncRNA-靶点对,分别见表1。

  参与这些网络的靶点包括植物过氧化物酶、交替氧化酶、过氧化物酶、转录因子、E3泛素-蛋白连接酶等。这些INcRNAs-靶点对可能在防御D.zeae感染方面起着调节作用。


  5. 在不相容的相互作用中lncRNA-miRNA网络的串扰

  在此之前,两个miRNAs,osa-mir 396和osa-mir 156分别被证明参与了水稻的防御反应。利用lncRNA测序数据预测了lncRNA作为miR396和miR156潜在的ceRNAs模拟物,并分析了它们的表达变化(表2)。TCONS_00042166、TCONS_00064123和TCONS_00081640三种LncRNA被预测为OSA-miR 396的ceRNAs模拟(表2)。6个lncRNA,TCONS_00012844、TCONS_00043299、TCONS_00102384、TCONS_00102574、TCONS_00072934和TCONS_00013133被预测为osai - mir156的ceRNAs(表2)。值得注意的是,一些mRNA基因可能是miRNA osamiR156和osa-miR396的靶标,预测为泛素蛋白连接酶,液泡分选受体蛋白,酯酶蛋白和参与防御反应的转录因子(表2)表明lncRNA可以在不相容的相互作用中调节miRNA抵抗D.zeae。


  表2 抗性水稻中lncRNA作为ceRNAs对D. zeae应答反应的表达谱


  6. D.zeae响应型IncRNAs的验证

  随机选取17个差异表达的LncRNAs进行qPCR分析。在17种lncRNA中,13种显著上调,4种显著下调(表3)。

  表3 根据归一化数据和随机选取的rna-seq数据,随机选择了17个差异表达的lncRNAs

  qPCR分析结果证实了17个lncRNAs的表达变化,尽管三个lncRNAs(TCONS_00064963,TCONS_00044026和TCONS_00012775)显示相反的结果(图6)。


  Fig.6 用qPCR方法验证了RNA-seq中的INcRNA。(A)和(B)分别用qPCR验证了10个上调的和7个下调的lncRNAs的表达水平。

  随机选取10个靶点(5个上调基因和5个下调基因对D. zeae应答反应),通过qPCR检测其差异表达模式(图7)。尽管RNAseq(图7A)和qPCR(图7B和C)的变化程度不同,但这10个基因的表达模式是一致的。


  Fig.7 用qPCR方法检测10个靶标的表达水平。(A)在不相容的相互作用中,根据归一化读码数,有10个显著差异表达的目标基因。(B)和(C)用qPCR分析5个上调和下调靶点的表达水平。a表明K1与K2之间有显着性差异(P<0.05)。


  4.总结

  在这项研究中,使用RNA-seq鉴定和表征抗性水稻品种中针对D. zeae感染的lncRNAs。共检测到4709个IncRNAs,2518个上调,2191个下调。用qPCR方法检测了所筛选的lncRNAs及其靶基因的RNA-seq表达水平。部分INcRNAs被预测为miRNAs的靶基因。本研究的结果为进一步了解lncRNA在水稻细菌性基腐病抗性调控中的作用提供了依据,也为今后通过产生lncRNA转基因植株来培育耐基腐病的水稻提供了潜在的途径。


  参考文献:

  https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2018/ra/c8ra04993a