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文献解读

集思慧远客户发表《褪黑素对水稻白叶枯病菌生长的抑制作用》

发布日期:2019-03-17 浏览次数:337



  水稻白叶枯病(Xoo)引起水稻细菌性疫病(BB),是世界各地水稻生长最广泛、危害最严重的病害之一。褪黑素通过诱导植物天然免疫增强病原菌抗性,但褪黑素对植物致病菌的直接作用尚不清楚。本论文研究了褪黑素对Xoo的直接作用,结果表明外源性褪黑素200μg/mL可明显抑制Xoo的增殖,降低5个细胞分裂相关基因的mRNA表达。这种浓度的褪黑素也抑制了Xoo的运动和生物膜的形成。值得注意的是,褪黑素可以改变Xoo细胞的长度。为了更深入地了解这种抗菌作用的机制,本研究采用RNA-Seq检测了200μg/mL褪黑素对Xoo菌株PXO99全局基因表达的影响。褪黑素处理后,Xoo细胞中与催化活性和金属结合活性相关的差异表达基因(DEGS)被下调。此外,对碳水化合物和氨基酸代谢的DEGs也受到下调。这些结果提示褪黑素抑制Xoo增殖的机制可能涉及调节细胞分裂,同时降低参与新陈代谢的酶的浓度或活性。


  材料与方法

  细菌菌株与植物

  采用剪叶法对水稻叶片接种Xoo菌株PXO99进行致病性试验。用无针注射器法对烟叶接种PXO99进行过敏反应(HR)监测。


  褪黑素对细菌生长影响的测定

  对不同浓度(0、200、400或1000μg/mL)褪黑素及无褪黑素(0μg/mL)的甲醇(MeOH)溶剂处理的细菌菌株每3h测定一次OD600,直至细菌生长达到静止阶段。每个实验进行三次,每个实验重复三次。


  透射电镜观察

  对不同浓度(0、200或400μg/mL)褪黑素及无褪黑素(0μg/mL)的甲醇(MeOH)溶剂处理的细菌标本做阴性染色,然后用相机拍摄。


  细胞运动和生物膜形成的测定

  对不同浓度(0、10、40或250μg/mL)褪黑素及无褪黑素(0μg/mL)的甲醇(MeOH)溶剂处理的Xoo菌株PXO99进行细胞运动和生物膜测定,每个实验进行三次,每次实验分别重复五次和六次。


  内源性褪黑素的测定

  利用LC-MS对不同浓度褪黑素(0或200μg/mL)处理的Xoo菌株PXO99进行内源性褪黑素含量的检测。


  RNA测序与数据分析

  不同处理:MOH(M0)和200μg/mL褪黑素(M200)

  检测平台:Illumina HiSeq Xten

  差异基因筛选条件:log2FC>2,p<0.01

  实时荧光定量

  采用qRT-PCR技术对选取的18个基因进行了验证分析。


  结果与讨论


  1.褪黑素抑制Xoo生长

  图1褪黑素抑制Xoo的生长

  注:(A)在褪黑素处理下,PXO99的状况。(B)对不同浓度褪黑素(μg/mL)处理后培养24h的PXO99生长曲线进行统计分析。

  甲醇(模拟对照)和不同浓度褪黑素处理的Xoo细菌生长速率(图1A)。褪黑素(200μg/mL)预处理24h后,PXO99的OD600值约为1.0,仅为对照组的一半(图1B)。因此,200μg/mL的褪黑素能有效地抑制PXO99的生长。当浓度升高时,细菌密度显示出更大的降低。褪黑激素在一定浓度下抑制人类致病细菌的生长,包括在2µg/mL的无乳链球菌和1000µg/mL的酿酒酵母中。生长抑制结果表明,褪黑素以浓度依赖性的方式抑制PXO99的生长,其抑制作用可能是剂量依赖性的。

  

  2.褪黑素减少Xoo泳动能力但增加生物膜形成


  图2褪黑素处理对Xoo泳动力(A)和生物膜形成(B)影响的统计分析


  为研究褪黑素对细菌运动的影响,测定了褪黑素存在和不存在时Xoo的游动直径。由于观察到较高浓度的褪黑素破坏了Xoo的泳动能力。因此,在随后的试验中,褪黑素的用量不超过200µg/mL。如图2A所示,10µg/mL褪黑素平板的菌落直径比模拟对照减少了30%以上。随着褪黑素浓度的增加,泳动直径进一步减小。200µg/mLL褪黑素平板的菌落直径比模拟对照减少一半以上。因此,褪黑素以浓度依赖性的方式影响Xoo的运动。这些结果显示褪黑素对细菌运动的抑制作用可能是通过增加细胞死亡来实现的,尽管有必要对此进行进一步的研究。


  为评价褪黑素对Xoo附着的影响,分析了PXO99在褪黑素挑战下的生物膜形成情况。如图2B所示,10μg/mL褪黑素的存在稍微增加了PXO99的生物膜形成。当褪黑素浓度增加时,OD595处的CV吸光度增加幅度较大。观察到的含有40μg/mL褪黑激素的管的OD595值比模拟对照高三倍。然而,当褪黑素存在于高浓度时,则观察到相反的效果。在含褪黑素200μg/mL的试管中,OD595值比对照组低40%。因此,褪黑素对PXO99生物膜形成的影响与观察到的对游动或生长抑制的影响不相似。当褪黑素浓度较高时,无游动或生物膜形成。结果表明,低浓度褪黑素可诱导Xoo形成生物膜,高浓度时则抑制其形成。


  

  3.Xoo因褪黑素而高度富集

  图3 Xoo中褪黑素的提取与鉴定

  注:(A)与褪黑素相对应的色谱图。(a)与未使用褪黑激素(Sigma)处理的PxO99细胞收集的褪黑素相对应的色谱图。(b)用褪黑素(Sigma)预处理PXO99细胞收集的褪黑素相对应的色谱图。(B)PXO99细胞褪黑素(ng/cells)的统计分析。紫外响应:280nm。


  利用LC-MS测定了褪黑素对PXO99细胞内源性褪黑素含量的影响。30mL培养液培养24h后,POX99细胞内源性褪黑素为14.43ng。与外源性褪黑素共同孵育的POX99细胞培养24h后,从30mL培养液中分离得到内源性褪黑素156.13ng(图3A)。结果表明,褪黑素可以很容易地穿过细胞壁,并在Xoo细胞中富集。处理组内源性褪黑素约为对照组的100倍(图3B)。这种破坏正常内源性褪黑素水平的Xoo可能会抑制这种细菌的增殖。


  4.褪黑素抑制Xoo细胞分裂

  图4褪黑素作用下Xoo细胞分裂相关基因mRNA表达的qRT-PCR分析


  为探讨褪黑素是否通过干扰或抑制细胞分裂而抑制细菌增殖,用qRT-PCR方法检测了褪黑素(200μg/mL)对PXO99细胞分裂相关基因的mRNA表达。如图4所示,与对照组相比,褪黑素处理的Xoo细胞中有4个细胞分裂相关基因(FetQ、ZapE、FetL和FetE)被上调,5种基因(ZipA、FetB、ZapA、FetD和FetZ)表达下调。结果表明,褪黑素处理导致Xoo细胞分裂减少。因为细菌的增殖取决于细胞的分裂能力,在细胞分裂过程中,Xoo的生长受到抑制。


  5.褪黑素改变Xoo形态


  图5褪黑素处理后Xoo形态的观察

  注:(A)PXO99细胞的形态:(A)不经褪黑素处理的PXO99细胞的形态;(B)褪黑素处理的PXO99细胞的形态(200μg/mL)。(B)对PXO99细胞宽度和长度的统计分析。Bar=0.5m。


  本研究通过透射电镜观察褪黑素对PXO99细胞形态的影响。如图5所示,使用负染色法通过TEM容易地区分细菌大小和形状。单个PXO99细胞的宽度和长度分别为0.6至1.0µm和1.0至2.7µm(图5A)。相比之下,褪黑素处理的PXO99细胞的宽度略短于对照组,200μg/mL的褪黑素处理的PXO99细胞的长度与对照相比明显减少(20%)(图5B)。这些数据表明褪黑素处理后PXO99细胞长度的减少可能是由于抑制Xoo增殖所致。


  6.褪黑素处理Xoo的RNA-Seq转录体分析


  为进一步探讨褪黑素对Xoo增殖的影响机制,收集了褪黑素处理或未处理的PXO99细胞的总RNA,并进行了RNA-Seq分析。通过对RNA-seq检测得到的基因表达变化的分析表明,138个基因在处理后21h对褪黑素的刺激下,mRNA转录水平发生了改变(表1),相当于Xoo基因组的2.73%。共有14个上调基因,124个下调基因,并且这些DEGs通过GO数据库来表征,GO数据库提供关于细胞组分,分子功能和生物过程的注释信息,并通过KEGG数据库注释。其中,在14个上调基因中,4个在鞭毛成分中富集,4个在转运活性上富集,3个参与代谢过程。


  图6基因本体论(GO)富集和细胞图谱对差异表达基因的分类


  图7通过qRT-PCR在mRNA水平上对18个差异表达基因的验证


  在观察到的下调基因中,与细胞膜和细胞成分相关的基因在细胞成分类别中有明显的过度表达(图6A)。此外,编码催化活性相关蛋白的基因在分子功能类别中被过度表达(图6B)。一致地,观察到与生物过程类别中的代谢过程相关的基因的显著过度表达(图6C)。在代谢过程中,有41个基因在生物过程中占主导地位(图6C)。催化活性和金属结合活性分别有56个和27个基因在分子功能类别中占主导地位(图6B)。为验证转录产物的可靠性,采用qRT-PCR技术对随机选取的18个基因进行了分析,结果与测序数据一致(图7)。在褪黑素处理的PXO99中,与氧化磷酸化、柠檬酸循环、蛋白质分泌和双组分系统相关的基因被下调。


  7.褪黑素调节Xoo代谢

  图8褪黑素处理下PXO99代谢差异基因的分类


  代谢是细菌的一个重要特征,据报道褪黑素能显著降低微生物代谢相关基因的mRNA表达。在这项研究中,我们观察到参与碳水化合物和氨基酸代谢的基因是丰富的(图8)。Xoo生长的最佳碳源和氮源是蔗糖和谷氨酸。有趣的是,参与异生物代谢的18个基因被下调(图8)。褪黑素具有很强的结合铜和铁(III)的能力。因此,我们推测褪黑素可以导致细菌细胞游离铁缺乏,并通过抑制褪黑素的金属结合活性或通过降低金属结合酶的浓度和活性来抑制生长。此外,位于细胞膜上与磷酸转运蛋白和参与能量代谢的磷酸盐结合蛋白相关的DEGs编码蛋白均被下调(图8)。


  结论

  本研究探讨了褪黑素对稻瘟病菌(X.oryzae,PV.Oryzae)的潜在作用。我们的数据显示褪黑素可以穿过细胞壁,在Xoo细胞中富集,抑制这种细菌的细胞分裂和增殖。重要的是,褪黑素改变了细胞结构,降低了Xoo细胞的泳动能力和附着能力。转录组分析结果提示褪黑素对Xoo增殖的抑制作用可能是通过(1)减少细胞分裂,(2)降低代谢相关酶的浓度和活性来实现的。本工作为进一步了解褪黑素对细菌生长和基因表达的抑制作用提供了新的思路。