日本比目鱼的基因组和转录组联合分析其不对称结构

  摘要：  

  鲽鱼是身体结构不对称的脊椎动物。在变态发育期间，一只眼睛迁移到颅骨的对侧，同时颅面发生转变，色素沉积也倾向一侧。这种生理的演变过程依然神秘。

  本文比对分析两种鲽鱼的基因组和转录组，发现甲状腺激素、视黄酸信号以及光换能途径起主要作用。研究证明视黄酸在不对称的色素沉积中起关键作用，和甲状腺激素共同作用，调节眼睛迁移。皮肤光换能途径中出现了视蛋白的表达，引发了光照差异，导致视黄酸梯度产生，形成不对称。鉴别这一独特发展过程的遗传基础，有助于了解不对称结构的长期进化起源，以及脊椎动物调控身体形态的机制。

  实验材料：  

  暂养雌核发育（假受精）的日本比目鱼，收集血液用于提取DNA。  

  在培养箱中孵育单批受精卵产生日本比目鱼和半滑舌鳎幼鱼。  

  幼鱼喂养小活虾（卤虫无节幼体），直到变态结束。  

  正常变态阶段基于眼部迁移：  

  变态初期（眼睛迁移前阶段；日本比目鱼-孵化后16d、半滑舌鳎-15d）；  

  变态前期（眼睛开始迁移；日本比目鱼21DAH，半滑舌鳎18DAH）；  

  变态期（眼睛迁移的上边缘超过背面边缘；日本比目鱼25DAH，半滑舌鳎19DAH）；  

  变态后期（眼睛迁移通过背中线；日本比目鱼29DAH，半滑舌鳎22DAH）。  

  鱼约3个月大时，从日本比目鱼和半滑舌鳎的两侧收集皮肤，研究不对称色素沉积。  

  将2-巯基-1-甲基咪唑直接溶解，并对变态期的日本比目鱼注射4天，以抑制内源性TH（甲状腺激素）合成。  

  用于整体原位RNA杂交、免疫组织化学和细胞增殖分析的幼鱼麻醉后在4％多聚甲醛（PFA）中固定过夜，储存在4℃甲醇中。用于RNA和DNA提取的幼鱼保存在-80℃。

  实验方法：

  1、基因组测序和组装  

  提取一个雌性日本比目鱼的DNA。Illumina HiSeq 2000。  

  为了确保随机性，构建了170bp，500bp，800bp，2kb，5kb，10kb，20kb和40kb插入片段的8个双端测序文库。用SOAP denovo组装。使用k-mer（17kb）估计基因组大小，约为640Mb。

  组装出日本鲽高质量的基因组546M。

  产生52.6 Gb的有效测序数据，高覆盖率（120 X），contig和scaffold的N50分别为30.5 kb和3.9 Mb。

  日本鲽鱼24条假定染色体的基因组。几乎所有组装的片段（98％）都锚定到遗传图谱上。从外至内圆依次是：重复覆盖，基因密度，GC含量。d和e分别表示由相应的半滑舌鳎和鲽鱼祖先染色体绘制的日本比目鱼染色体。f，日本比目鱼全基因组内的直系同源基因。

  2、转录组测序和分析  

  Illumina HiSeq 2000。PE 90bp。20.5G。  

  TopHat用于比对。DEseq和Cuffdiff检测DEG。  

  日本鲽中鉴定了21,787个蛋白质编码基因。在两者中共同鉴定到2,307个差异表达的直系同源基因（DEGs）。

  Sbs-盲测的皮肤；Sos-眼测的皮肤。

  8个硬骨鱼物种中直系同源基因家族的维恩图。在8个硬骨鱼中共保存了11693个基因家族。日本鲽和舌鳎的物种特异性基因家族分别为63和128个。日本鲽和舌鳎共有的153个基因家族。

  3、基因家族进化  

  构建了两种鲽鱼和其他六个有参考基因组的鱼（G.aculeatus三刺鱼，O. latipes青鳉，T. Rubripes河豚，T.nigroviridis黑斑鲀，O.niloticus罗非鱼和D.rerio斑马鱼）的系统发育树。

  4、整个幼虫的免疫组织化学和免疫荧光

  5、显微注射  

  向盲侧的眼眶下区域显微注射50nl来确定RA对16,18,21,23,26,28和30DAH幼虫中的眼迁移的作用。无注射对照组1（自然发育）；DMSO对照组2（RA载体）；全反式RA组（ATRA）；9cRA组（9-顺式-RA）；13cRA组（13-顺式-RA）。  

  研究RA显微注射对日本鲽的不对称身体着色的影响，在皮肤下用ATRA，9-顺式-RA和DMSO对照组2（RA载体）在28,31,34,37,40,43,47和50DAH下显微注射幼虫。

  6、整体原位RNA杂交

  7、酵母双杂

  8、通过与串联质谱联用的超高效液相色谱（UPLC-MS / MS）检测RA浓度。

  研究结果：

  1、鲽鱼变态和系统发育进化。

  （a）日本比目鱼的的变态过程。  

  （b）八种硬骨鱼类的最大似然树。基因家族扩增事件的数量以绿色表示，基因家族收缩事件的数量以粉红色表示。12个基因家族在鲽鱼中扩增。其中Hipk涉及p53介导的细胞凋亡、调节眼尺寸、晶状体形成、晚胚胎期间的视网膜分层。  

  （c）Hipk（与同源结构域相互作用蛋白激酶）基因家族在鲽鱼中特异性的扩增。硬骨鱼中Hipk蛋白的系统发育产生两个主要簇。一个簇（左侧）包含Hipk1，Hipk2和Hipk3的三个亚组。各亚组中各物种的基因数目非常相似。Hipk蛋白的第二簇（右侧）中富集鲽鱼特异性的基因家族扩增，Hipk2-like（Hipk2 *）进化枝中富集半滑舌鳎，Hipk1-like（Hipk1 *）进化枝中富集日本比目鱼。

  2、鲽鱼的视觉适应。  

  在鲽鱼祖先中鉴定了106个正选择的基因（PSG），与轴向模式（irx5和usp16），神经模式（arid1a和igsf8），肌肉骨骼重建（bmp1，ano6，col10a1，pepd，nr1d2，mybpc1和myo1h），甲状腺激素（notch2），视黄酸（RA）信号传导（aldh1l1，aldh3b1和rdh14）和光转导途径基因（gucy2f和grk1）。

  （a）鲽鱼中光转导途径的正选择基因。鲽鱼祖先中的正选择基因（gucy2f和grk1）以粉红色突出显示。仅在日本鲽鱼中的正选择基因（grk6，grk7，pde6b和guca1b）以橙色突出显示。  

  （b）日本比目鱼和半滑舌鳎中，光转导途径的基因在变态过程中的阶段特异性差异表达。除了rgs9，rcvrn和calml4，各基因表达在变态前期到变态后期逐渐增加。 

  （c）Gucy2f的ANF受体和PK_GC-2D的功能结构域，鲽鱼特异性的突变（灰色阴影）。  

  （d）Gucy2f的三维模型中特异性突变的位置。一个阳性选择的位点（Phe737；蓝色）位于α-螺旋中，另一个位点（Gly205；粉色）在无规卷曲上。

  3、鲽鱼眼迁移的分子特征。  

  在20世纪80年代初确定了THs在鲽鱼变态中的作用。TH是对脊椎动物变态必需的。  

  在日本鲽鱼变态期间，眼睛周围的甲状腺素（T4），三碘甲状腺原氨酸（T3），脱碘酶2（dio2），dio3，thraa和thrb1的表达量分布模式随着变态发生而改变。 

  用荧光原位杂交，研究dio2、dio3、T4、T3、thraa、thrab、thrb1、thrb2、随着变态发生，在皮肤周围的不均匀表达。 

  使用阻断TH合成的抑制剂甲巯咪唑（MMI）抑制眼部迁移，减少dio3、thraa、thrb1的不均匀表达。

  （a）眼睛迁移中TH信号和RA信号之间的假定串扰，可能造成鲽鱼的不对称。鲽鱼变态中RA和TH之间的串扰包括Thrb和Rar配体之间的竞争。  

  酵母双杂交实验表明：Thraa与Rxra、Thrb1与Rxrb相互作用的。  

  （b）在日本鲽鱼不同变态阶段注射不同RA亚型，对眼睛迁移的抑制。对Rxrs和Rars有最高亲和力的9-顺式-RA和ATRA最有效地抑制了眼睛迁移，而对受体具有低亲和力的13-顺式-RA效果较差。  

  （c）显微注射RA引起的代表性表型。图像显示在注射9-顺式-RA（盲侧）或ATRA（盲侧）的鲽鱼中观察到的眼睛对称性；注射13-顺式-RA（眼侧）或DMSO（眼侧）的鲽鱼中观察到眼不对称。底部的图像显示盲侧眼的眶下区域中的细胞增殖。注射9-顺式-RA和ATRA的日本鲽的盲侧眼眶中的增殖细胞比对照少。  

  在变态期间，日本鲽的眼睛迁移直接受RA-和TH诱导的信号传导途径的相互作用调节。

  4、视蛋白造成鲽鱼变态时不对称的视黄酸梯度。  

  鲽鱼变态期间，颜色也变得不对称，并且眼睛迁移和皮肤中不对称色素沉积之间存在关联。推测左右不对称的RA梯度对眼睛迁移有影响，对不对称的色素沉积也有影响。  

  通过测定色素沉积（眼侧）和未着色（盲侧）皮肤中RA的浓度，并比较日本比目鱼和中国舌鳎的两种皮肤转录组。RA浓度在眼和盲侧皮肤有显着差异。  

  鲽鱼变态期间，光转导途径的基因（rh1，rh2，lws，sws1和sws2）在皮肤中普遍存在表达。  

  推测不对称色素沉积和眼睛迁移期间，两侧不同的RA梯度可能是由于身体倾斜，眼侧光暴露增加。  

（a）日本比目鱼变态过程，皮肤中aldh3的不对称表达模式。在变态前幼鱼的两侧没有检测到aldh3的表达差异，但是在变态后幼鱼中存在大的差异。白色箭头表示阳性信  

  （b）日本比目鱼的变态期间，皮肤中视蛋白（sws2）普遍存在表达。黑色箭头表示阳性信号。  

  （c）蓝光照射幼鱼（上）和未照射的对照（下）100d后的盲侧（左）和眼侧（右）的成体生色团分布。  

  将变态前幼鱼的盲和眼侧用白光或不同波长的光照射。  

  中等长度和长波长（红色，黄色和绿色）的光导致在盲目侧出现一些色素斑点，而短波长（蓝色和紫色）的光引起大量的色素显现。成体生色团在两侧均匀发育，类似于注射RA后的情况。表明在蓝光照明下的光感受器可以刺激RA的产生。而且，在蓝光照射下，眼睛没有发生迁移。  

  （d）通过三色荧光原位杂交，检测后变态阶段的鱼中，rxra，kit和sws2在皮肤色素细胞中的共表达。rxra，kit和sws2 mRNA分别用地高辛（红色），生物素（绿色）和荧光素（蓝色）检测。  

  与色素细胞发育相关的kit基因与色素细胞中蓝色敏感的rho蛋白（sws2）和rxra的基因共表达（图4d）。  

  表明Sws2促进RA的合成，在鲽鱼的左右不对称色素形成期间调节Rxra。

  亮点分析：

  1、测了日本比目鱼的高质量基因组，通过比对分析两种比目鱼（半滑舌鳎、日本比目鱼）的基因组与转录组，发现了甲状腺激素和视黄酸信号转导，以及光换能(phototransduction)过程在这个发育进程中的重要作用。  

  2、鉴定了调节变态发育和建立身体不对称结构的基因和发育途径。揭示了在变态期间，皮肤中视蛋白调节RA梯度。TH和RA信号分子合作作用于眼部迁移和皮肤色素沉积。

  参考文献：  

  The genome and transcriptome of Japanese flounder provide insights into flatfish asymmetry.  

  2016.12-Nature Genetics, IF= 31.616